王 群，曾曉玲，余 蕾，趙淑云

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，貴州 貴陽 550004）

目前出生缺陷逐漸成為嬰兒死亡的主要原因以及導(dǎo)致兒童殘疾的重要原因。2012年在《中國(guó)出生缺陷防治報(bào)告》中統(tǒng)計(jì)顯示：我國(guó)是出生缺陷的高發(fā)國(guó)家，我國(guó)出生缺陷的發(fā)生率約為5.6%，每年約有25萬例在出生時(shí)有明顯臨床可見出生缺陷。臨床常見染色體異常遺傳疾病有唐氏綜合征(21-三體)、愛德華綜合征(18-三體)、Patau綜合征(13-三體)、Turner綜合征(45,X)、Klinefelter綜合征(47,XXY)，在產(chǎn)前診斷疾病中約占80%。2013年在《全國(guó)婦幼衛(wèi)生信息分析報(bào)告》中顯示：先天性心臟病、多指（趾）、總唇裂、先天性腦積水以及馬蹄內(nèi)翻在2012年出生缺陷患兒中位居前5位。很多染色體微缺失、微重復(fù)異?？蓪?dǎo)致新生兒出現(xiàn)上述缺陷。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，不明原因的智力低下、多發(fā)畸形及發(fā)育遲緩中約有12%是由染色體微缺失/微重復(fù)所致。目前則主要通過實(shí)施產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)對(duì)出生缺陷進(jìn)行篩查，并采取相應(yīng)干預(yù)措施以降低出生缺陷的發(fā)生率。

1 產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展

產(chǎn)前篩查常用方法有：血清學(xué)篩查（二聯(lián)法檢出率為71%，假陽性率為5%；三聯(lián)法檢出率71%，假陽性率5%；四聯(lián)法檢出率83%，假陽性率8%[1]）、產(chǎn)前超聲測(cè)定胎兒頸項(xiàng)透明層 (NT)厚度、系統(tǒng)超聲等。對(duì)于孕母血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)患者則需進(jìn)一步行侵入性產(chǎn)前診斷（羊水穿刺、臍血穿刺、胎兒鏡）。目前最為廣泛應(yīng)用的的血清學(xué)篩查技術(shù)因其較低的檢出率導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生率增加，侵入性手段會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)（絨毛穿刺：1%～3%。羊膜腔穿刺：0.2%～0.5%、臍靜脈穿刺：1%～2%）、宮內(nèi)感染等不良妊娠結(jié)局[2]，且絨毛取樣還存在不能回避限制性胎盤嵌合問題的弊端[3]。兩者均在經(jīng)濟(jì)及精神方面為社會(huì)及家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)，且較高的假陽性率增加了不必要的侵入性產(chǎn)前診斷，增加了正常胎兒丟失的風(fēng)險(xiǎn)，降低了產(chǎn)前診斷的依從性[4]。因此，人們希望一種快速、準(zhǔn)確且無創(chuàng)的產(chǎn)前檢測(cè)方法的誕生。

隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展，在1997年有學(xué)者在孕婦外周血中檢測(cè)到胎兒游離DNA(cell-free fetalDNA,cffDNA)并且應(yīng)用于檢測(cè)胎兒性別以篩查與性別相關(guān)疾病的胎兒。cffDNA幾乎全部來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，最早可在妊娠第4周的母體外周血中被檢測(cè)出來，在妊娠7周胎兒胎盤循環(huán)建立后，cffDNA即在母體外周血中以一定的比例穩(wěn)定存在，且可達(dá)到檢測(cè)的濃度要求[5]。在孕10周后可在幾乎所有的孕婦外周血中檢測(cè)出[3]。cffDNA在母體血漿游離DNA總量中僅占5%～30%,其隨孕周的增大而增多。cffDNA片段大小為75～250bp，分娩后母體外周血中cffDNA可快速降解，故多孕次孕婦的產(chǎn)前診斷結(jié)果不受前一次妊娠時(shí)cffDNA的干擾[4]。此種方法是通過抽取孕婦外周血進(jìn)行檢測(cè)，是一種無創(chuàng)的產(chǎn)前檢測(cè)方法。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)（ next generation sequencing,NGS）的發(fā)明與發(fā)展，孕婦外周血行胎兒非整倍體評(píng)估的NIPT技術(shù)使產(chǎn)前篩查步入更為廣闊的發(fā)展空間。NIPT主要的檢測(cè)范圍為胎兒的21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征，與傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查相比較而言有著更高的準(zhǔn)確性及更低的假陽性率。且已在臨床應(yīng)用中取得顯著成效。在2012年美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)(the American college of obstetricians and gynecologists,ACOG)及美國(guó)母胎醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)(the Society for maternal-fetal medicine,SMFM)均推薦NIPT作為非整倍體高危人群的一種初篩檢測(cè)。因NIPT具有高敏感性、高特異性、低假陽性率及無創(chuàng)性等優(yōu)點(diǎn)使其在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于臨床。

2 NIPT在胎兒染色體微缺失微重復(fù)檢測(cè)的研究進(jìn)展

隨著高通量測(cè)序深度的提高，NIPT技術(shù)得到了進(jìn)一步的拓展，且國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量的臨床研究。2011年新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志中有學(xué)者報(bào)道了首例無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒微缺失綜合征；Waper[6]等于研究中發(fā)現(xiàn)胎兒22q11.2缺失的檢出率為97.8%，假陽性率為0.76%；1p36缺失、Cri-duchat綜合征、Prader-Willi綜合征及Angelman綜合征的檢出率均為100%，假陽性率為0%。盡管染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的發(fā)病率目前還不是非常明確，但有研究發(fā)現(xiàn)染色體微缺失/微重復(fù)在母體染色體正常的胎兒中發(fā)生率也可達(dá)1%～1.7%。相關(guān)臨床研究表明：核型正常的情況下，6% B超顯示異常和1.7%高齡或唐篩陽性的病例中存在致病性染色體拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)。然而與染色體非整倍體疾病不同，致病CNV的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與孕婦年齡并沒有密切的關(guān)聯(lián)，提示針對(duì)低齡孕婦（三大常染色體非整倍體的低風(fēng)險(xiǎn)人群）中胎兒可能出現(xiàn)致病CNV的風(fēng)險(xiǎn)目前是被忽視的。依托高通量測(cè)序技術(shù)，通過對(duì)孕婦外周血中胎兒游離DNA的檢測(cè)，盡可能多的判斷胎兒染色體疾病已成為行業(yè)風(fēng)向，并在世界范圍內(nèi)被應(yīng)用于實(shí)踐。基于以上研究，各大國(guó)際機(jī)構(gòu)均擴(kuò)大了NIPT的篩查范圍。2015年，意大利報(bào)道了第一例應(yīng)用Panorama TM Plus檢測(cè)出胎兒DiGeorge綜合征。趙永和[7]等發(fā)現(xiàn)：NIPT檢測(cè)結(jié)果顯示13號(hào)、18號(hào)染色體微缺失病例各一例，18號(hào)染色體微重復(fù)病例經(jīng)染色體微陣列分析(Chromosomal Microarray Analysis CMA)證實(shí)為陽性結(jié)果。但近年，有相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)了NIPT在篩查微缺失微重復(fù)層面存在的假陰性/陽性病例。池一嬋[8]等人的研究中發(fā)現(xiàn)一例NIPT提示CHr18長(zhǎng)臂末端存在缺失及重復(fù)，而微陣列比較基因組雜交（array based comparative genomic hybridization，Array-CGH）檢測(cè)結(jié)果顯示缺失而未見重復(fù)，胎兒引產(chǎn)后取臍靜脈血行基因檢測(cè)結(jié)果顯示缺失，未見重復(fù)，死胎外觀雙手重疊指、耳位底、貫通掌，尸檢見肝大、多囊腎等異常。此項(xiàng)研究中還顯示NIPT檢測(cè)假陽性病例4例（7號(hào)染色體偏多），經(jīng)Array-CGH檢測(cè)及超聲隨訪均未見異常，產(chǎn)后新生兒表型正常；假陰性病例1例，因超聲提示脛骨發(fā)育異常行NIPT提示未見異常，繼而行Array-CGH檢測(cè)及核型分析，核型分析結(jié)果未見異常，Array-CGH檢測(cè)結(jié)果提示10q11.22區(qū)段微重復(fù)，而此區(qū)段微重復(fù)可導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常。周靜[9]等人報(bào)道1例NIPT陰性的病例，在新生兒出生后表現(xiàn)為頸后皮膚后綴、鼻梁低平，經(jīng)核型分析及Array-CGH檢測(cè)均證實(shí)為4號(hào)染色體短臂缺失，為WOLF綜合征； 胡芷陽[10]等人的研究中證實(shí)1例假陽性病例，該病例母親血測(cè)序發(fā)現(xiàn)有微重復(fù)情況。有研究發(fā)現(xiàn)：NIPT可檢測(cè)300kb以上胎兒基因組微缺失/微重復(fù)，然而對(duì)于小于300kb的片段則可出現(xiàn)假陰性或假陽性[11]。目前普遍采用的NIPT計(jì)算模式假設(shè)所有母親全部片段的DNA拷貝數(shù)是一致的，因此如果母體有缺失或重復(fù)時(shí)，就可能造成NIPT結(jié)果的假陽性或假陰性。故對(duì)于NIPT篩查出的微缺失/微重復(fù)必須行進(jìn)一步產(chǎn)前診斷來明確診斷，以排除假陰性/假陽性導(dǎo)致的胎兒不良結(jié)局。柯瑋琳[12]等應(yīng)用Array-CGH證實(shí)染色體核型分析對(duì)CNV總的漏診率為46.2%。較高的漏診率表明染色體核型分析在CNV層面上具有明顯的局限性。染色體核型分析技術(shù)雖為最經(jīng)典和常見的診斷方法，但分辨率較低，一般只能檢測(cè)出10Mb以上的重復(fù)、缺失、易位等結(jié)構(gòu)異常，幾乎所有＜5MB染色體不平衡畸變不能被染色體核型分析識(shí)別。Array-CGH為診斷CNV提供了高分辨率全基因組篩選，并且可以被用于檢測(cè)未知基因組DNA片段的增減，但Array-CGH 不能檢測(cè)出平衡易位、倒位等不存在染色缺失、重復(fù)的結(jié)構(gòu)異常，也不能檢測(cè)出多倍體及低比例嵌合[13]， 故NIPT篩查出的微缺失/微重復(fù)病例可進(jìn)一步行染色體核型分析及Array-CGH檢測(cè)明確診斷，兩者結(jié)合可降低CNV的漏診率。

有公司推出覆蓋常見的三大染色體、性染色體及高發(fā)微缺失微重復(fù)綜合征的無創(chuàng)檢測(cè)項(xiàng)目。微缺失/微重復(fù)綜合征主要包括以下7種：22q11.2 deletion 綜合征（含Digeorge綜合征）、1p36 deletion 綜合征、2q33.1 deletion 綜合征、Cri-Du-Chat綜合征、Langer-Giedion綜合征、Angelman綜合征、Prader-Willi 綜合征。截止2016年6月在DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄關(guān)于有明確CNV注釋的疾病，其中有命名的染色體微缺失/微重復(fù)綜合征達(dá)70余種，病例達(dá)50000多例。但國(guó)際產(chǎn)前診斷學(xué)會(huì)（international society for prenatal diagnosis,ISPD）表示NIPT擴(kuò)展檢測(cè)應(yīng)當(dāng)局限于在研究清楚的微缺失/微重復(fù)綜合征范圍內(nèi)，且需要結(jié)合臨床。因NIPT存在假陽性、假陰性結(jié)果，NIPT檢測(cè)出的染色體微缺失/微重復(fù)病例應(yīng)結(jié)合B超隨訪結(jié)果、染色體核型分析及染色體微陣列分析/Array-CGH檢測(cè)結(jié)果綜合分析后決定胎兒的存留，而對(duì)于陰性結(jié)果則應(yīng)超聲隨訪，必要時(shí)行產(chǎn)前診斷明確是否存在CNV。因CNV存在基因多態(tài)性，且并非所有檢測(cè)出的微缺失/微重復(fù)均可致病，故應(yīng)慎重向家屬解釋染色體微缺失/微重復(fù)結(jié)果，且現(xiàn)仍缺少大規(guī)模的前瞻性臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)，應(yīng)慎重應(yīng)用于常規(guī)產(chǎn)前篩查。