劉樹業(yè)

劉樹業(yè), 天津市第三中心醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心 天津市 300170

核心提要: 外泌體是細胞外囊泡的一種亞型, 參與癌癥進展、轉移、免疫調節(jié)、血管生成和組織再生等生理和病理過程.通過外源性或內源性方法選擇性操控外泌體內容物可以為肝細胞癌的個體化治療提供依據, 是癌癥診斷和治療的潛在工具.

0 引言

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)死亡率居全球第二, 且發(fā)病率逐年上升.2013年美國有約30640例新發(fā)病例和21670例死亡病例[1].由于病原學因素, HCC的發(fā)病率在不同年齡、性別、種族和地理區(qū)域不同.近年來, 盡管預防和篩查手段有所改善, 診斷和治療的新技術也得到了發(fā)展, 但HCC的發(fā)病率和死亡率未降反升[2].70%-90%的HCC患者患病主要危險因素是慢性肝炎和由肝炎發(fā)展而來的肝硬化[3].全球大多數(shù)HCC病例與慢性乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染有關, 其他常見的危險因素包括丙肝病毒(hepatitis C virus, HCV)感染、酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)和非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)[4].目前, 主要的治療方法包括肝移植和手術切除.手術切除患者五年生存率能達到50%-70%, 肝移植的患者5年的總生存率約為75%-85%.然而, 由于發(fā)現(xiàn)即處于疾病晚期導致只有不到30%的患者能夠進行手術治療[5,6].

任何監(jiān)測指標都需要能做到早期檢測, 從而增加有效手術干預的機會.通常包括血清生物標志物[如甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)], 腹部超聲(ultrasound, US),計算機成像(computde tonography, CT), 磁共振(magnetic resonance imaging, MRI), 肝臟活檢[7]等.30%的HCC患者血清AFP水平升高, 且AFP水平＞400 ng/mL與HCC[7]高度相關.然而, AFP敏感性較差, 經常漏檢早期的小腫瘤.因此, 需要更有效的生物標記物來改進小腫瘤的檢測.

細胞外囊泡是惡性腫瘤潛在的生物標志物之一.細胞外囊泡是由細胞釋放到胞外空間并被雙層脂質膜包裹的內含細胞蛋白、脂質、DNA和RNA的微小囊泡.大量證據表明這些囊泡可以作為細胞間通信的一種機制[8].外泌體是細胞外囊泡的一種亞型, 參與多種生理和病理過程, 包括癌癥進展、轉移、免疫調節(jié)、血管生成和組織再生等.外泌體也被認為是癌癥診斷和治療的潛在工具[9,10].通過外源性或內源性方法選擇性操控外泌體內容物可以為HCC的個體化治療提供依據.本綜述目的在于總結和評估外泌體在HCC發(fā)生發(fā)展和治療中的作用.

1 外泌體生物學及在腫瘤中的作用

外泌體直徑在40-100 nm間, 具有雙層膜結構, 由細胞以胞吐方式分泌到細胞外.幾乎所有細胞可以分泌外泌體.外泌體廣泛存在人體的血、尿、腹 腔積液等體液中, 以及培養(yǎng)細胞[11]的上清液中.

外泌體的形成機制中最經典的是內體分選復合物(endosomal sorting complexs required for transport,ESCRT)途徑[5].多泡體(multivesicular body, MVB)與細胞膜的融合、胞吐及外泌體的釋放密切相關.CD81、CD63等蛋白可作為外泌體的鑒定標志[10].另外, MVB還可以通過多種途徑參與胞內多泡體的分選和多種細胞器形態(tài)的發(fā)生相關[6].

最新研究顯示腫瘤外泌體的主要效應是免疫抑制[9].異常細胞間信息交流導致腫瘤發(fā)生.外泌體通過激活間質纖維母細胞與細胞外基質相互作用, 產生轉移前微環(huán)境, 抑制宿主免疫反應和誘導血管生成等方式參與腫瘤的產生、生長、發(fā)展和化療耐藥[12].免疫抑制微環(huán)境的產生是腫瘤發(fā)病機制的重要前提, 而外泌體參與了許多免疫抑制過程[13].

Melo等[14]在癌源外泌體中發(fā)現(xiàn)了與miR生物合成和促進腫瘤發(fā)生有關的復合物蛋白、DICER、TRBP和AGO2.Chowdhury等[15]發(fā)現(xiàn)來自惡性細胞的外泌體能夠轉化脂肪來源的間充質干細胞(MSC)成為支持腫瘤生長和血管生成的肌成纖維細胞細胞.

miR-126被報道[16]通過胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1, IRS1)調節(jié)血管生成和癌癥代謝.IRS1通過何種機制支持腫瘤生長還不完全清楚.一種假設是通過胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)放大信號, 而IGF1R參與細胞分裂生成、血管生成、轉化、分化、組織調控以及細胞凋亡和細胞活力的調控[17].

癌細胞通過攜帶高水平microRNA 122(miR-122)[18]抑制非腫瘤細胞對葡萄糖的攝取.miR-122是膽固醇和脂肪酸代謝的重要調節(jié)因子, 可導致脂質儲存和代謝失衡[19], 也可通過“轉移前微環(huán)境”促進癌細胞增殖和轉移.此外, 有研究發(fā)現(xiàn)miR-122具肝臟特異性.因其負載的脂肪間充質干細胞(Axungemesenchymal stem cell, AMSC)外泌體(122-Exo)使HCC細胞變得敏感, 提示AMSC外泌體可能是HCC治療中抗腫瘤miR的新型載體[19].

2 外泌體在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用

HCC源性外泌體中蛋白質和RNA含量與正常細胞含量差異很大[20].這些外泌體可以被其他細胞吸收, 因此在腫瘤的局部擴散、肝內轉移和多灶性生長中起著重要作用.肝臟微環(huán)境是誘導免疫反應如耐受性、抵抗病毒感染的炎癥反應和腫瘤免疫監(jiān)測的關鍵因素.外泌體中的生物活性RNA和蛋白能夠影響腫瘤的微環(huán)境, 從而導致HCC的發(fā)展和轉移.

2.1 外泌體對HCC細胞增殖及轉移的作用 HCC源性外泌體促進受體細胞中轉化因子的生長、參與促進肝癌的局部擴散、肝內轉移和多灶性生長[20,21].HepG2細胞通過分泌IGF1來對抗導入的miR-122, 進而抑制鄰近細胞內產生miR-122, 調節(jié)微環(huán)境, 促進細胞增殖, 表明miR-122和IGF1都是潛在的治療靶點.免疫細胞中miR在細胞間轉移可作為抵抗有害細胞增殖或腫瘤生長的防御機制[22].巨噬細胞通過miR-142和miR-223抑制癌HCC細胞的增殖[22].

超保守區(qū)域RNA(ucRNA)的轉移是外泌體影響細胞間信號傳遞的新機制.在HCC源性外泌體中, 表達ucRNA量最高的是TUC339.TUC339參與調節(jié)腫瘤細胞的生長、黏附和擴散.有體外研究發(fā)現(xiàn)小干擾RNA(short RNA, siRNA)通過抑制TUC339降低了HCC細胞的增殖, 其轉染的HCC細胞由于ECM細胞黏附減少, 增殖和轉移潛能明顯增加, 促進腫瘤微環(huán)境中的細胞間相互作用[23].

外泌體與p53信號轉導途徑也有著密切的關系.核孔蛋白Nup98是p53基因選擇性調節(jié)器.有報道稱Nup98以Nup98 siRNAs的形式轉移到HepG2肝癌細胞(野生型p53)時, 影響p21的表達, 提示Nup98在調控p53靶基因選擇方面發(fā)揮著重要作用[24].在人類肝癌細胞外泌體中還發(fā)現(xiàn)了轉谷氨酰胺酶2(TGM2)和annexin A2兩種肝細胞相關蛋白.TGM2通過外泌體介導的非經典途徑分泌,可能是一種有價值的腫瘤標志物[25].

He等[26]發(fā)現(xiàn)肝癌細胞系(HKCI-C3, HKCI-8,MHCC97L和MIHA)產生的外泌體通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT和MAPK信號通路, 導致活性基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌增加, 提示HCC來源的外泌體可動員正常肝細胞.

在體外實驗中, Vps4A抑制HCC細胞的生長、菌落形成和遷移及侵襲[21], 通過PI3K/AKT通路的滅活改善細胞對外泌體的反應, 隨腫瘤進展和轉移在HCC組織中下調[27].通過小RNA測序發(fā)現(xiàn), VPS4A促進了外泌體中致癌miRNA和細胞中抑癌miRNA的積累和攝取[12].

2.2 外泌體在肝細胞癌血管微環(huán)境生成中的作用 HCC是一種高密度血管侵潤的實體腫瘤, 索拉非尼等抗血管生成治療對總體生存率的改善有限[7,10].因腫瘤中存在癌癥干細胞(cancer stem cells, CSCs), CSCs主要通過釋放血管生成因子和外泌體來驅動血管生成.另一方面,腫瘤微環(huán)境中的血管也通過鄰分泌和旁分泌機制釋放生長因子, 以支持CSCs的生長并維持其干細胞特征.肝腫瘤血管生成與CSCs之間的正反饋循環(huán)加速形成了腫瘤進展的血管微環(huán)境[28].

血管加壓素(vasorin, VASN)是一種跨膜蛋白, 在腫瘤發(fā)生和血管生成中起關鍵作用, 是腫瘤與內皮細胞間通信的關鍵因素[29].最新研究表明VASN在HCC中的血清和組織樣本中高度表達, 其水平隨增殖和轉移程度增加[30].值得注意的是, hepG2來源的VASN通過外泌體可促進受體人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的遷移到HUVECs中[29].

3 外泌體在HCC診斷中的作用

外泌體廣泛存在于人體血液、尿液中, 穩(wěn)定、易獲得,故外泌體內含物具有潛在生物標記功能, 可成為較理想的臨床診斷和疾病復發(fā)預測的生物標記物.

miR-939和miR-595都是HCC的獨立危險因素[31].此外, 根據受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic, ROC)分析, miR-939, miR-595和miR-519作為HCC診斷或預后標志物優(yōu)于Alpha fetoprotein (AFP)[31],說明外泌體miRNA作為早期HCC分子生物標志物仍值得進一步研究.

與慢性乙型肝炎患者和肝硬化患者相比, HCC患者血清外泌體miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224的水平上調, miR-101水平下調.miR-21與慢性乙型肝炎高度相關(r= 0.636,P= 0.048); mir-221與肝硬化相關(r=0.770,P= 0.009); mir-222和mir-224與肝癌相關(r= 0.547,P= 0.012;r= 0.508,P= 0.022)[32].Wang等[33]發(fā)現(xiàn)HCC患者血清外泌體miR-21水平高于慢性乙型肝炎患者或健康志愿者, 且其高表達與肝硬化和晚期腫瘤有關.血清miR-21的敏感性遠低于血清外泌體miR-21[33].與血清相比, 血清外泌體miR-21更適合作為HCC診斷的潛在生物標志物.

Liu等[34]通過實驗表明, 與血清AFP水平相比, 血清外泌體miR-10b、miR-21、miR-122和miR-200a水平與肝癌顯著相關.當外源體和血清miR與AFP聯(lián)合監(jiān)測HCC時, 其預測能力增強.

與慢性HCV相比, 丙肝相關HCC血清外泌體miR-16明顯低于HCV患者.對HCV患者血清miR-16進行ROC分析, 當cutoff值為0.904時, 其敏感性和特異性分別為57.5%和70%.血清miR-16與AFP聯(lián)合使用可提高靈敏度(85%)和診斷準確率(87.5%).此外, 血清miR-199a和miR-16水平與HCC腫瘤的大小和數(shù)量相關[35].

4 外泌體在HCC免疫治療中的作用

晚期HCC對傳統(tǒng)化療策略具有耐藥性.一方而在抗腫瘤藥物的刺激下, HCC細胞可以分泌耐受性外泌體以增強NK細胞的自溶作用和減弱HSP的抗腫瘤效應.另一方而, 鉑類和伊立替康等抗腫瘤藥產生更多含HSP的外泌體, 可能會上調并激活NK細胞受體CD69, NKG2D,NKp44的表達, 同時下調CD94表達, 增加了顆粒酶B的產生和激活NK細胞的細胞毒性反應[36].Takahashi等[37]評估了外泌體信號傳遞在肝癌對TGF-β反應中的作用,指出 TGF-β降低了HCC細胞對索拉菲尼和鏈霉素的敏感性, 從而增加了化療耐藥性.HCC源性外泌體內CD9和CD63激活HGF/c-MET/AKT信號通路誘導索拉菲尼抗體產生, 并抑制索拉菲尼誘導的細胞凋亡.此外, 高侵襲腫瘤細胞外泌體CD9和CD63表達更強, 因而更易發(fā)生索拉菲尼耐藥[38].

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)通過腫瘤微環(huán)境影響肝細胞癌的生長[39,40].骨髓基質細胞(BMSCs)能夠自我更新和發(fā)育成多種譜系, 其抗腫瘤活性由白細胞介素2(IL-2)和干擾素β(IFN-β)等細胞因子誘導[41].在IFN-?存在的情況下, 骨髓間充質干細胞與腫瘤分泌的外泌體(TEX)在共同培養(yǎng)中, 由于BMSC與細胞周期的相互作用以及G0/G1期細胞的阻滯, HCC細胞(H22細胞系)的增殖受到抑制[39].骨髓間充質干細胞來源的外泌體也是有效的運輸治療性siRNA和紫杉醇等活性藥物的載體[42].說明骨髓間充質干細胞來源的外泌體可能是一種很有前途的藥物傳遞載體.

脂肪源性間充質干細胞(AMSC)分泌的外泌體促進T細胞抗腫瘤效應[40].與HCC腫瘤細胞來源外泌體(exosomes, TEX)脈沖節(jié)律一致的樹突狀細胞(DC)通過增加激活性T細胞和干擾素(IFN)-r水平, 降低抗炎cytokines、IL-10和TGF-b水平, 誘導細胞免疫反應[43].AMSC外泌體可作為miRNA的有效運載體, 實現(xiàn)特定miRNA向肝癌細胞的傳遞,通過調控腫瘤相關靶基因的表達進而發(fā)揮miRNA的抗肝癌或化療增敏作用.

5 外泌體在HCC肝移植復發(fā)中的作用

研究發(fā)現(xiàn)在接受肝移植的HCC患者中, 血清外泌體中的miR-718和miR-1246可作為為肝移植手術后HCC復發(fā)的標志物[44].在微陣列芯片分析時發(fā)現(xiàn)miR-718低表達與肝癌轉移和侵襲性相關.在轉染Huh7細胞前體mir-718時, 發(fā)現(xiàn)細胞增殖受到抑制[44].miR-718的靶點是HOXB8表達, 其上調與HCC患者整體生存率和無復發(fā)率顯著相關.因此, miR可以作為肝細胞癌肝移植后復發(fā)的生物標志物.

6 結論

本文旨在總結外泌體生物學特性及其在肝癌發(fā)生發(fā)展、診斷和治療中的作用作一簡要綜述.HCC對傳統(tǒng)的化療手段有很強的抵抗力.索拉非尼、5-氟尿嘧啶和阿霉素是目前全身性或局部性疾病的標準治療方法, 但療效有限.因此, 需要發(fā)現(xiàn)新的治療靶點并開發(fā)新的臨床方法來提高肝癌化療敏感性.腫瘤細胞來源的外泌體對癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉移和復發(fā)有著復雜而重要的作用, 故對肝癌患者體液中外泌體miRNA進行檢測和分析能夠為癌癥的早期診斷、治療效果評估和預后提供一定的參考和依據.

然而, 外泌體廣泛應用于肝臟惡性腫瘤尚需解決以下問題: (1)缺乏建立可靠的參考基因來評估血清外泌體靶miRNA的表達水平; (2)循環(huán)miR在診斷各種肝臟疾病中的敏感性和特異性之間存在差異; (3)miR診斷受血清、組織、體液和外泌體miR表達差異的影響[31-34]; (4)外泌體的分泌水平及其所載蛋白質組成可能隨體外培養(yǎng)介質的不同而變化[45].

未來的研究需要進一步闡明外泌體作為肝癌患者篩查、診斷和治療靶點的確切作用和可靠性, 從而實現(xiàn)個性化治療.