陳 瞧, 李佳憶, 杜順達(dá)

陳瞧, 李佳憶, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京市 100005

杜順達(dá), 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科 北京市 100730

核心提要: 腫瘤免疫治療的有效性與免疫細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別能力密切相關(guān), 利用二代外顯子測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析研究腫瘤新抗原, 可為腫瘤的精準(zhǔn)治療和預(yù)后預(yù)測(cè)提供新方向和可能.

0 引言

隨著新一代測(cè)序成本的下降、多肽設(shè)計(jì)制作技術(shù)的成熟和計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步, 找出腫瘤細(xì)胞不同于正常細(xì)胞的抗原成為可能.這類抗原被稱為腫瘤新抗原.腫瘤新抗原可以用來(lái)培養(yǎng)靶向性更強(qiáng)的T淋巴細(xì)胞, 可以用于免疫檢查點(diǎn)封鎖療法應(yīng)答的預(yù)測(cè), 也可以用于治療性疫苗接種策略, 因而在診斷和治療中的潛在用途越發(fā)重要.

1 腫瘤的抗原和新抗原

根據(jù)抗原的特異性程度, 腫瘤抗原分為: 腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen, TSA)、腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen, TAA)和癌癥生殖/癌癥睪丸抗原(cancer-testis antigen, CTA).CTA是指在腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)但在正常細(xì)胞中低水平表達(dá)的一類抗原.TAA能夠直接參與致癌過(guò)程, 如在維爾姆斯腫瘤1(WT1[1]或Her2/neu)[2]中作為有促生長(zhǎng)功能的蛋白; 也可以異常磷酸化后作用于蛋白質(zhì)翻譯后的修飾過(guò)程[3].TSA也稱為腫瘤新抗原(neoantigen), 是由非同義突變和其他遺傳改變引起的、在正常宿主基因組中不編碼的一類抗原, 可以表現(xiàn)為由體細(xì)胞突變而產(chǎn)生的致癌病毒蛋白或異常蛋白[4].因?yàn)門(mén)SA誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞能夠更好的適應(yīng)免疫耐受機(jī)制, 因此和抗原有更強(qiáng)的親和力, 意味著TSA能夠更好地引導(dǎo)靶向作用[5].CTA由各種腫瘤類型和生殖組織(例如睪丸, 胎兒卵巢和滋養(yǎng)層細(xì)胞)表達(dá), 但在成人的其他正常組織中表達(dá)有限, 且不存在于不表達(dá)MHC Ⅰ類分子的正常生殖細(xì)胞上[6].

TSA、TAA和CTA都被認(rèn)為是免疫治療的目標(biāo).到目前為止, 大多數(shù)癌癥疫苗都集中在通常過(guò)度表達(dá)的TAA上, 因?yàn)橄嗤闹委熜砸呙缒軌蛑委煾鞣N不同的腫瘤.雖然CTA靶點(diǎn)也在腫瘤之間共享, 但已知它們僅在有限數(shù)量的腫瘤類型中表達(dá), 這大大降低了CTA靶向免疫治療的適用性.

然而, 大多數(shù)以TAA為靶向的疫苗嘗試都只取得了有限的成功, 并且伴隨著較為嚴(yán)重的副作用.這可能是因?yàn)門(mén)AA也是正常的宿主蛋白質(zhì), 因此受到中樞和外周耐受機(jī)制的影響.與此同時(shí), 研究發(fā)現(xiàn)一些起到治療作用的TAA特異性T細(xì)胞很快出現(xiàn)治療無(wú)效, 其中原因可能是盡管一些TAA特異性T細(xì)胞確實(shí)避免了陰性選擇,但TAA的高親和性TCR被優(yōu)先消耗, 剩下的其余TCR的親和力很低, 我們知道T細(xì)胞的細(xì)胞毒性和活化與TCR結(jié)合親和力相關(guān), 因此一段時(shí)間后治療效果無(wú)法維持.而TSA特異性T細(xì)胞的TCR親和力遠(yuǎn)高于TAA, TSA在惡性腫瘤治療中逐步受到重視.

2 腫瘤的免疫效應(yīng)機(jī)制及免疫治療

腫瘤新抗原的發(fā)現(xiàn)提供了一種通過(guò)機(jī)體的免疫系統(tǒng)治療腫瘤的思路, 即利用對(duì)抗原性異物的識(shí)別和清除能力, 殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞, 達(dá)到控制惡性腫瘤的目的, 進(jìn)而延長(zhǎng)惡性腫瘤患者的生存期甚至達(dá)到治愈的目的.

機(jī)體識(shí)別和清除抗原性異物的功能被稱為免疫監(jiān)視[7].腫瘤細(xì)胞突變產(chǎn)生的新抗原就是一種抗原性異物,當(dāng)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生新抗原時(shí), 機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠通過(guò)免疫監(jiān)視發(fā)揮抗腫瘤的效應(yīng).目前發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤的免疫效應(yīng)主要由細(xì)胞免疫所介導(dǎo), 主要包括: 依賴于MHC Ⅰ類分子的CD8+ CTL細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷機(jī)制、依賴于MHC Ⅱ類分子的CD4+ Th細(xì)胞的抗腫瘤免疫輔助作用、非MHC限制的γδT細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷機(jī)制、CD1d誘導(dǎo)活化的NKT細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷機(jī)制、NK細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷機(jī)制、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴因子等的非特異性殺傷和抑制腫瘤作用等.近年來(lái), 又提出了免疫編輯理論, 認(rèn)為腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用中, 免疫監(jiān)視只是其中一個(gè)階段, 隨后還要經(jīng)過(guò)免疫平衡和免疫逃逸階段, 這也對(duì)免疫治療提出了挑戰(zhàn).

在此基礎(chǔ)上, 經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)幾十年的腫瘤免疫治療的探索, 目前腫瘤的免疫治療主要分為: 主動(dòng)免疫療法、被動(dòng)免疫療法和免疫檢查點(diǎn)抑制療法等.

主動(dòng)免疫治療是通過(guò)激活患者自身免疫系統(tǒng), 利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng), 從而增強(qiáng)機(jī)體的抗癌能力, 阻止腫瘤的生長(zhǎng)、擴(kuò)散和復(fù)發(fā), 最終達(dá)到清除或控制腫瘤的目的.被動(dòng)免疫療法即細(xì)胞免疫療法, 又稱為細(xì)胞過(guò)繼免疫療法, 其原理是將患者體內(nèi)自身抗腫瘤的免疫細(xì)胞進(jìn)行體外改造, 讓這些細(xì)胞具備對(duì)癌細(xì)胞更有效、更精準(zhǔn)的免疫能力.改造后的免疫細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后, 它們會(huì)定向消滅癌細(xì)胞.這類療法主要利用的免疫細(xì)胞包括LAK、DC、CIK、DC-CIK、CAR-T、TCR-T、NK、CAR-NK以及腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)等.其中, 很多免疫細(xì)胞因?yàn)橐恍┨厥庖蠡驀?yán)重的毒副反應(yīng)等[8]被淘汰, 而利用TIL的細(xì)胞過(guò)繼免疫療法則受到了關(guān)注.TIL是來(lái)源于浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞, 它能夠在體外良好擴(kuò)增,抗腫瘤作用強(qiáng)于LAK等細(xì)胞, 并且對(duì)IL-2的依賴性小[9].有研究證實(shí)[9]通過(guò)在體外用IL-2誘導(dǎo)激活、擴(kuò)增TIL, 進(jìn)而回輸TIL能夠高效而特異地殺傷腫瘤細(xì)胞.免疫抑制檢查點(diǎn)療法則是針對(duì)CTLA-4及PD-1的單克隆抗體藥物有效地抑制了上述抑制性檢查點(diǎn), 從而促進(jìn)了抗腫瘤免疫, 產(chǎn)生臨床療效.

如今, 篩選腫瘤特異性抗原已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了技術(shù)上的突破.通過(guò)使用NGS技術(shù)[10]和構(gòu)建算法模型, 外顯子測(cè)序[11]和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能得到腫瘤細(xì)胞的DNA和RNA的序列信息, 找出可能引起免疫細(xì)胞識(shí)別的腫瘤性突變.生物信息學(xué)工具的發(fā)展則提高了腫瘤新生抗原的篩選能力, 基因組大數(shù)據(jù)和計(jì)算機(jī)算法加速了腫瘤表位預(yù)測(cè)以及MHC親和力預(yù)測(cè), 進(jìn)而推動(dòng)了個(gè)體化腫瘤疫苗的發(fā)展.

3 新抗原在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

隨著腫瘤新抗原檢測(cè)和預(yù)測(cè)技術(shù)的突破, 基于新抗原的精準(zhǔn)免疫治療熱度不斷提高, 并且在多種腫瘤的免疫治療中取得了突破性的進(jìn)展.

3.1 細(xì)胞過(guò)繼免疫療法中的應(yīng)用 細(xì)胞過(guò)繼免疫療法的關(guān)鍵是過(guò)繼細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別.隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展, 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了個(gè)體化篩選腫瘤抗原和T細(xì)胞受體.多項(xiàng)個(gè)體化細(xì)胞過(guò)繼療法研究證實(shí), 通過(guò)篩選出能夠特異識(shí)別腫瘤突變抗原的TIL(多為T(mén)h1細(xì)胞), 能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷.

2011年在一項(xiàng)針對(duì)黑色素瘤的臨床試驗(yàn)中, 93例黑色素瘤患者接受了從腫瘤患者自身提取出的TIL輸注,有20例患者的腫瘤完全消退, 并且100%的患者生存時(shí)間超過(guò)3年[12].可惜的是, 這項(xiàng)研究對(duì)于TIL細(xì)胞識(shí)別的具體突變抗原仍然是未知的.2013年Robbins團(tuán)隊(duì)[13]繼而在這批接受TIL治療的患者中選擇了一個(gè)肝部結(jié)節(jié)得到有效緩解的患者, 用傳統(tǒng)的cDNA文庫(kù)篩選分離出了一個(gè)突變蛋白PPP1R3B, 并進(jìn)一步證實(shí)從這名患者外周血分離出的T淋巴細(xì)胞可以識(shí)別這種突變蛋白.另外, 他們還用全外顯子測(cè)序方法, 找出了突變的新抗原, 并用一種驗(yàn)證MHC結(jié)合力的算法驗(yàn)證了可以被三種TIL識(shí)別的新抗原[14].

通過(guò)以上對(duì)方法學(xué)和新抗原-TIL相互作用的驗(yàn)證,TIL回輸療法成為可能.全外顯子測(cè)序則給我們提供了一個(gè)全新的思路, 即通過(guò)測(cè)序獲得能被TIL識(shí)別的抗原和能識(shí)別新抗原的TIL細(xì)胞, 直接指導(dǎo)個(gè)體化治療.2014年Rosenberg團(tuán)隊(duì)[15]的個(gè)案報(bào)道實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤進(jìn)行測(cè)序及對(duì)靶向免疫細(xì)胞進(jìn)行篩選, 并成功指導(dǎo)治療的過(guò)程.他們招募了一個(gè)經(jīng)過(guò)多方案化療仍然持續(xù)進(jìn)展的已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的膽管癌患者, 用全外顯子測(cè)序的方法檢測(cè)出患者癌癥細(xì)胞中的26個(gè)非同義突變基因, 其中一個(gè)突變基因表達(dá)erbb2突變相互作用蛋白(ERBB2IP).他們發(fā)現(xiàn)從該患者腫瘤組織中分離出的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)含有的Vβ22+CD4+T輔助細(xì)胞1(Th1)細(xì)胞能夠特異識(shí)別ERBB2IP.隨后該團(tuán)隊(duì)在體外擴(kuò)增這種可以特異識(shí)別突變蛋白的T細(xì)胞, 用過(guò)繼細(xì)胞回輸?shù)姆椒ㄝ斎牒?5%濃度的有突變識(shí)別特異性的Th1細(xì)胞, 在7 mo隨訪時(shí), 肺和肝的轉(zhuǎn)移灶共縮小了30%.患者病情在隨訪至13 mo時(shí)依然穩(wěn)定.隨后出現(xiàn)肺部進(jìn)展, 再次向患者輸入含＞95%濃度的有突變識(shí)別特異性的Th1細(xì)胞, 在1 mo和6 mo隨訪時(shí), 研究者觀測(cè)到患者的肺轉(zhuǎn)移灶再次縮小.

2015年Rosenberg團(tuán)隊(duì)[16]對(duì)10名轉(zhuǎn)移性消化道腫瘤的患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了外顯子測(cè)序, 并證實(shí)了從9名患者體內(nèi)分離出的CD4+或CD8+細(xì)胞可以識(shí)別3種經(jīng)測(cè)序得到的新抗原.并且一名患者體內(nèi)分離出的含白細(xì)胞抗原-C*08:02-限制性T細(xì)胞受體的CD8+T細(xì)胞可以識(shí)別在很多消化道腫瘤中共有的突變KRAS G12D.2016年這一團(tuán)隊(duì)利用從這些結(jié)直腸癌患者中分離出的4種靶向KRAS G12D突變的CD8+T細(xì)胞, 在實(shí)驗(yàn)室中擴(kuò)增到一定的數(shù)量后, 通過(guò)靜脈回輸含75%濃度的TIL細(xì)胞到最后這名患者體內(nèi).結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在回輸后40天, 患者所有7個(gè)轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)消退, 且維持了9 mo.9 mo后, 其中一個(gè)病變出現(xiàn)進(jìn)展, 通過(guò)手術(shù)切除后維持了至少8 mo臨床無(wú)病狀態(tài).因此靶向共有突變的TIL細(xì)胞為治療的廣泛應(yīng)用前景廣泛[17].

3.2 個(gè)體化疫苗中的應(yīng)用 癌癥疫苗是通過(guò)向患者注射癌癥特異性元素以引發(fā)針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答, 提高了免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力[18].疫苗主要分為樹(shù)突細(xì)胞[19,20]、DNA[21]、RNA[22]和肽類[23], 各自有優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì).在體內(nèi), 疫苗的組分激活專職抗原呈遞細(xì)胞, 包括樹(shù)突細(xì)胞等, 樹(shù)突細(xì)胞接收并處理引入的抗原, 然后遷移到局部淋巴結(jié); 進(jìn)入淋巴結(jié)后樹(shù)突細(xì)胞通過(guò)MHC Ⅰ類或Ⅱ類分子在細(xì)胞表面展示抗原.TCR與MHC Ⅰ類分子/肽復(fù)合物連接后, 新抗原特異性T細(xì)胞被激活, 經(jīng)歷增殖并分化成CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞, 然后離開(kāi)淋巴結(jié)并靶向結(jié)合腫瘤表面顯示的抗原.類似地, CD4+T細(xì)胞也可以被激活.與傳統(tǒng)疫苗類似, 肽疫苗可以由許多肽和佐劑組成, 佐劑是一類旨在加強(qiáng)對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答的免疫刺激劑.到目前為止, 肽疫苗的耐受性良好, 治療相關(guān)的不良事件很少.研究者們利用靶向腫瘤特異性新抗原配制和注射突變的合成肽來(lái)制造個(gè)性化的治療性癌癥疫苗來(lái)治療惡性腫瘤.

表1 包括處于招募前、招募中、終止、撤銷、完成等狀態(tài)下的所有臨床試驗(yàn)(截止到2017-12)

有一部分治療性癌癥疫苗可能由于有缺陷的抗原靶標(biāo), 如免疫原性低, 抗原特異性低或腫瘤細(xì)胞表達(dá)水平低, 或弱佐劑而失敗[24].但也有成功研制的疫苗, 如:黑色素瘤疫苗[25-27]、胰腺癌疫苗[28]、多抗原疫苗[29].

關(guān)于腫瘤疫苗的研究層出不窮, 但是多數(shù)還停留在前期研究或者動(dòng)物水平表1也有完成了Ⅳ期試驗(yàn)的疫苗, 如坦佩雷大學(xué)醫(yī)院研究的治療慢性淋巴細(xì)胞白血病的肺炎球菌多糖疫苗.

4 新抗原輔助下對(duì)腫瘤預(yù)后的預(yù)測(cè)

腫瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制治療的反應(yīng)與新抗原的數(shù)目和免疫原性相關(guān)[30,31], 免疫檢查點(diǎn)抑制治療前進(jìn)行基因測(cè)序能夠評(píng)估治療的反應(yīng).2013年在一例對(duì)抗-CTLA4 Ipilimumab單抗療法有良好反應(yīng)的Ⅳ期黑色素瘤患者中, Van[32]進(jìn)行外顯子測(cè)序和T細(xì)胞反應(yīng)分析, 發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)出現(xiàn)了靶向針對(duì)兩個(gè)新抗原的T細(xì)胞.2016年McGranahan等[31]對(duì)接受PD-1抑制劑Pembrolizum單抗治療的進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行了外顯子測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)腫瘤新抗原數(shù)量越多且瘤內(nèi)異質(zhì)性越少的患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制治療敏感性更高, 并且總生存時(shí)間顯著延長(zhǎng).這顯示了新抗原在免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)行免疫治療的效果及預(yù)后預(yù)測(cè)方面的作用.

腫瘤新抗原還影響腫瘤患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制治療的耐藥性的產(chǎn)生.2017年Anagnostou等[30]對(duì)接受抗PD-1/抗CTLA-4抗體治療后產(chǎn)生耐藥性的非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行全外顯子測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)耐藥性的腫瘤丟失了一部分新抗原并產(chǎn)生了新的突變, 這些丟失的新抗原與剩余的新抗原相比, 有更強(qiáng)的MHC結(jié)合力.

此外, 對(duì)一些惡性腫瘤的分析也發(fā)現(xiàn), 新抗原與腫瘤患者的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間相關(guān).Balachandran等[33,34]通過(guò)對(duì)胰腺癌腫瘤細(xì)胞進(jìn)行外顯子測(cè)序、MHC結(jié)合力、TCR測(cè)序及T細(xì)胞亞群分析發(fā)現(xiàn),新抗原數(shù)目、新抗原與MHC的結(jié)合力以及CD3+CD8+型T細(xì)胞多的個(gè)體生存期顯著延長(zhǎng).Choudhury等[35]在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者中發(fā)現(xiàn), 表達(dá)更高的新抗原數(shù)目和更低的TCRβ多樣性的患者可以獲得更長(zhǎng)的無(wú)復(fù)發(fā)生存期.Matsushita等[36]則在腎臟透明細(xì)胞癌患者中發(fā)現(xiàn), 同時(shí)表達(dá)更高的新抗原數(shù)目和HLA分子的患者有更好的臨床預(yù)后.Strickland等[37]也在高級(jí)別漿液性卵巢癌的患者中發(fā)現(xiàn)有更高新抗原負(fù)荷的患者總生存率更高.

這些研究提示對(duì)腫瘤進(jìn)行基因測(cè)序在一定程度上可以預(yù)測(cè)其生存期, 并且測(cè)序結(jié)果可能提示對(duì)相應(yīng)治療的療效反應(yīng).

5 結(jié)論

新抗原帶來(lái)的個(gè)性化免疫治療可能治愈高風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)展患者, 迄今已有較多臨床研究取得了可喜的成績(jī).然而未來(lái)還存在巨大的挑戰(zhàn).我們需要更多關(guān)于新抗原處理和呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)、改進(jìn)預(yù)測(cè)算法, 以選擇最理想的免疫原性表位.腫瘤過(guò)繼免疫療法中使用的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞主要來(lái)源于腫瘤組織, 制備的過(guò)程有創(chuàng)傷且需要一定時(shí)間.而疫苗的生產(chǎn)需要更快、更經(jīng)濟(jì)、更高效的方法,同時(shí)尋找最佳新抗原靶點(diǎn)也是需要解決的問(wèn)題.探索幾種免疫療法的聯(lián)合應(yīng)用, 可以使療法適用更為廣泛腫瘤患者, 并且提高療效.在惡性腫瘤的療效預(yù)測(cè)和生存期分析方面, 新抗原起了一定作用, 發(fā)現(xiàn)更為精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn), 將為腫瘤的精準(zhǔn)化治療帶來(lái)新的希望.