叢衡日 張明 萇浩曉 杜利 尹琳琳 張星虎

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種累及中樞白質(zhì)病變的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，具體病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，炎性浸潤和髓鞘脫失是其主要的病理特征[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要免疫細(xì)胞可能參與了MS的發(fā)病過程，但小膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)病急性期或復(fù)發(fā)期中的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究MS的動(dòng)物經(jīng)典模型，其病理特征與MS相似，為研究小膠質(zhì)細(xì)胞在MS發(fā)病機(jī)制中的作用提供了很大幫助。既往的研究顯示不同類型的PLP肽段可在一定程度上誘導(dǎo)存在復(fù)發(fā)緩解病程的EAE模型，但以髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白139-151(proteolipid protein，PLP139-151)誘導(dǎo)造模效果最佳[2]，但不同研究應(yīng)用的PLP139-151劑量也不盡相同[3-4]，目前尚缺乏對(duì)PLP139-151誘導(dǎo)EAE模型的最佳劑量的相關(guān)探索。且現(xiàn)有研究多針對(duì)PLP139-151誘導(dǎo)EAE模型的第一次發(fā)作期進(jìn)行研究，對(duì)其緩解后再復(fù)發(fā)的相關(guān)研究較少。本研究擬通過PLP139-151誘導(dǎo)SJL小鼠構(gòu)建EAE實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型模擬MS復(fù)發(fā)緩解的特點(diǎn)[5]，借助病理學(xué)染色技術(shù)觀察EAE模型緩解后二次復(fù)發(fā)時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，為MS藥物研發(fā)或機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)、提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡(體重14～19 g)的SJL雌性小鼠30只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001〕，飼養(yǎng)在動(dòng)物房恒溫恒濕(24°C，濕度55%～65%)的環(huán)境1周。

1.2 主要抗原和試劑PLP139-151多肽片段(HSLGKWLGHPDKF，純度HPLC>95%)由北京中科亞光生物科技有限公司提供。不完全弗氏佐劑(incomplete freund adjuvant，IFA；貨號(hào)263910)，熱滅活結(jié)合分枝桿菌(killed mycobacterium tubercusis H37 Ra，MTB；貨號(hào)231141)，均由DIFCO公司提供；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX；貨號(hào)3097)由R&D公司提供。免疫抗原的配制：1 mg PLP139-151多肽片段(由試劑公司分裝成1 mg/管)加0.67或0.5 mL滅菌生理鹽水配制成濃度為1.49和1.00 mg/mL的多肽溶液；向IFA中加適量已滅活的MTB，得到MTB的終濃度為8 mg/mL的完全福氏佐劑；將多肽溶液與新制的完全弗氏佐劑等體積混合，用注射器來回抽打，乳化0.5 h以上，使抗原乳化劑中含PLP139-151多肽0.75或0.5 mg/mL和MTB 4 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將每只SJL小鼠編號(hào)，隨機(jī)分為健康對(duì)照組(對(duì)照組)，100 μg PLP模型組，150 μg PLP模型組，每組各10只。

免疫當(dāng)天記為第0天，在小鼠背腹兩側(cè)分多點(diǎn)注射含PLP乳化劑，0.2 mL/只(每0.2 mL乳化劑中含PLP 100 μg或150 μg，以及MTB 400 μg)，誘發(fā)EAE模型；對(duì)照組小鼠注射等體積不含PLP多肽的完全弗氏佐劑。兩模型組均于免疫后即刻和48 h分別腹腔注射PTX 0.2 mL(含PTX 200 ng)各1次，對(duì)照組小鼠相同時(shí)點(diǎn)注射等體積生理鹽水。免疫后連續(xù)觀察各組小鼠35 d。

1.3.2動(dòng)物模型神經(jīng)功能評(píng)分：健康對(duì)照、100 μg PLP模型組、150 μg PLP模型組小鼠，每組隨機(jī)選取5只，從免疫當(dāng)天起，每日觀察其動(dòng)物行為學(xué)變化，比較各組神經(jīng)功能殘疾進(jìn)展評(píng)分差異及EAE發(fā)病情況。各組神經(jīng)功能評(píng)分計(jì)算每日均值。神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[6]：0分：正常，無病理癥狀；1分：鼠尾張力完全消失；2分：一側(cè)后肢癱瘓；3分：雙后肢完全癱瘓；4分：一側(cè)或前肢完全癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)。在各組連續(xù)評(píng)分觀察時(shí)以各組神經(jīng)功能評(píng)分達(dá)最高分時(shí)定義為發(fā)病達(dá)高峰，以免疫后最先發(fā)病達(dá)高峰組定義為早發(fā)病。比較各組免疫后發(fā)病達(dá)高峰時(shí)間及復(fù)發(fā)時(shí)達(dá)高峰時(shí)間早晚，同時(shí)比較達(dá)高峰時(shí)兩組神經(jīng)功能評(píng)分差異。選擇兩EAE模型組中發(fā)病快、發(fā)病高峰神經(jīng)功能殘疾進(jìn)展評(píng)分高者(計(jì)作EAE組)進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活性變化情況。

1.3.3組織病理學(xué)檢查觀察小膠質(zhì)細(xì)胞：免疫后第28天隨機(jī)選取對(duì)照組及EAE組(即150 μg PLP組)小鼠各5只進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。小鼠經(jīng)10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛(按體質(zhì)量3.5 mL/kg)麻醉后，固定，打開胸腔，暴露心臟，去掉心包膜，穿刺針從左心尖插向主動(dòng)脈，止血鉗固定針頭，剪開右心耳，依次注入生理鹽水，4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛灌注，開顱取全腦，置于含30%(質(zhì)量濃度)蔗糖的4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛后固定液中固定。濾紙吸干多余的后固定液，浸入異戊烷，置于液氮，速凍約15 s，加預(yù)冷的雙蒸水(ddH2O)，包被腦組織，切成20 μm厚的冠狀切片待用。每只動(dòng)物挑取相近斷面的皮層切片2張，分別進(jìn)行Iba-1相關(guān)免疫組織化學(xué)(immunohistochemical，IHC)染色和免疫熒光(immunofluorescence，IF)染色，于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組Iba-1染色情況并拍攝照片，觀察分析Iba-1細(xì)胞表達(dá)情況及細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，正常狀態(tài)下小鼠大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞多呈靜息狀態(tài)，組織染色上表現(xiàn)為Iba-1輕度著色(IHC)，低熒光強(qiáng)度(IF)，胞體較小，分支很少發(fā)生重疊；如小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)Iba-1染色著色加深，熒光強(qiáng)度增高，胞體變大，突起及分支增多狀態(tài)時(shí)表明小膠質(zhì)細(xì)胞呈活化狀態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)(最小值，最大值)表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠發(fā)病情況及神經(jīng)功能評(píng)分比較150 μg PLP組和100 μg PLP組誘導(dǎo)的EAE模型均表現(xiàn)出復(fù)發(fā)緩解的臨床進(jìn)程，發(fā)病期主要表現(xiàn)為活動(dòng)減少，進(jìn)食少，體重減輕和皮毛不光滑，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙體征，如尾部下垂無力，肢體癱瘓等，對(duì)照組無臨床發(fā)病及神經(jīng)功能缺損。兩模型組均未出現(xiàn)小鼠死亡，兩組均出現(xiàn)2個(gè)發(fā)病高峰，150 μg PLP組于免疫后第13、28天達(dá)高峰，100 μg PLP組于免疫后第15、31天出現(xiàn)發(fā)病高峰。150 μg PLP組第1個(gè)高峰時(shí)其神經(jīng)功能評(píng)分高于當(dāng)天100 μg PLP組(分別為3.00±0.71比1.50±0.35，t=4.24，P<0.01)；第2個(gè)發(fā)病高峰持續(xù)3 d后才逐漸緩解。100 μg PLP組于第1個(gè)發(fā)病高峰期最高神經(jīng)功能評(píng)分(3.00±0.35)，與150 μg PLP組第1次發(fā)病高峰期最高神經(jīng)功能評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.00，P>0.05)；100 μg PLP組第2個(gè)發(fā)病高峰期最高神經(jīng)功能評(píng)分小于150 μg PLP組第2個(gè)發(fā)病高峰期最高神經(jīng)功能評(píng)分(1.75±0.90比3.00±0.79，t=2.33，P<0.05)；150 μg PLP組小鼠在每個(gè)發(fā)病高峰均早于100 μg PLP組，神經(jīng)功能評(píng)分高于或等于100 μg PLP組(圖1)。綜上，確定以150 μg PLP組(計(jì)作EAE組)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，觀察復(fù)發(fā)期(造模后第28天)小膠質(zhì)細(xì)胞活性。

注：PLP：髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白 圖1 三組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.2 兩組腦組織病理學(xué)比較復(fù)發(fā)期(造模后第28天)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，EAE組與注射對(duì)應(yīng)等體積溶媒的對(duì)照組同期(第28天)比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞多呈靜息狀態(tài)，表現(xiàn)為Iba-1輕度著色，胞體較小；EAE組模型小鼠大腦皮層中Iba-1+細(xì)胞的表達(dá)明顯增多，Iba-1著色加深，著色胞體突起分支增多(圖2)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞活化增多；免疫熒光染色結(jié)果與免疫組化染色結(jié)果相似，同樣存在EAE組大腦皮層中Iba-1+細(xì)胞的表達(dá)明顯增多，免疫熒光增強(qiáng)，且伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變，體積增大，突起增多(圖3)，免疫組化染色及免疫熒光染色均表明，與對(duì)照組相比，EAE組小鼠大腦皮層中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化明顯增多。

3 討論

動(dòng)物模型為人類深入了解疾病發(fā)病機(jī)制及研發(fā)治療藥物提供了保障，MS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型有多種，包括病毒模型、化學(xué)毒素模型、EAE模型等。EAE模型是最常用的擬MS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，能夠較好模擬MS的臨床表現(xiàn)、病理特征。目前常用的免疫原為髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)[7]、PLP、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)等[8]。但無論是MBP或MOG多肽片段誘發(fā)的動(dòng)物模型均以急性發(fā)作為主，急性期維持時(shí)間短且多為單相病程。由于在MS患者中，約80%～85%為復(fù)發(fā)緩解型，PLP誘發(fā)的動(dòng)物模型具有維持時(shí)間長、復(fù)發(fā)緩解等特點(diǎn)，與臨床MS的復(fù)發(fā)緩解病程更相似，能更好地模擬疾病狀態(tài)。而既往針PLP誘導(dǎo)的EAE動(dòng)物模型的研究，也多集中在第一次發(fā)病期，針對(duì)其復(fù)發(fā)期的研究鮮有報(bào)道。由于在MS患者中，約80%～85%為復(fù)發(fā)緩解型，因此針對(duì)疾病復(fù)發(fā)期的研究同樣至關(guān)重要，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用針對(duì)EAE研究的出現(xiàn)頻率較高的兩個(gè)劑量150 μg 和100 μg PLP139-151成功誘導(dǎo)SJL小鼠發(fā)病建立EAE模型，并且成功觀察到疾病緩解復(fù)發(fā)的模擬臨床過程。研究結(jié)果顯示，150 μg PLP組小鼠在每個(gè)發(fā)病高峰均早于100 μg PLP組，且神經(jīng)功能評(píng)分高于或等于100 μg PLP組。 為了深入研究疾病復(fù)發(fā)期時(shí)EAE小鼠較對(duì)照組小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞的病理差異，本研究進(jìn)一步觀察了150 μg PLP139-151誘導(dǎo)的EAE模型緩解后二次復(fù)發(fā)時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。

注：A：對(duì)照組；B：EAE組；EAE：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，圖3同 圖2 EAE組和對(duì)照組小鼠大腦皮層Iba-1小膠質(zhì)細(xì)胞(標(biāo)記)表達(dá)(IHC)。 注：A：對(duì)照組；B：EAE組 圖3 EAE模型組和對(duì)照組小鼠大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1標(biāo)記)表達(dá)(IF)

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的免疫監(jiān)視細(xì)胞，相當(dāng)于CNS內(nèi)的巨噬細(xì)胞，是維持CNS免疫平衡的一道最主要防線。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到體內(nèi)外異物侵襲時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞一方面迅速活化，釋放大量的炎性因子、趨化因子、補(bǔ)體等，通過抗原呈遞、吞噬、細(xì)胞/體液免疫等過程，及時(shí)清除異物的侵襲或者清理機(jī)體內(nèi)死亡的細(xì)胞、碎屑等[9-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞幾乎參與了所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性病變及退行性疾病，如阿爾茲海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化等[12-13]。本研究觀察到在PLP誘導(dǎo)的復(fù)發(fā)緩解型EAE小鼠在疾病復(fù)發(fā)期腦組織中存在著Iba-1+細(xì)胞的表達(dá)明顯增多的現(xiàn)象，并且同時(shí)伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞體積增大，突起增多等相關(guān)的形態(tài)改變，提示EAE模型中可能存在小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)(圖2、3)，這進(jìn)一步提示在EAE發(fā)病過程中存在著小膠質(zhì)細(xì)胞的參與。與既往針對(duì)MS發(fā)病過程中的小膠質(zhì)細(xì)胞參與的研究是一致的，MS中小膠質(zhì)細(xì)胞激活后主要通過Toll樣受體活化下游通路，引起細(xì)胞內(nèi)炎性介質(zhì)釋放，進(jìn)而導(dǎo)致炎性反應(yīng)的發(fā)生。MS尸檢患者發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)病灶中存在大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤，提示MS病變用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)相關(guān)，進(jìn)而推測活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過激發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)參與了MS的發(fā)病[14]。本實(shí)驗(yàn)中EAE小鼠大腦皮層病理染色觀察到的小膠質(zhì)細(xì)胞改變進(jìn)一步表明PLP139-151成功誘導(dǎo)的EAE模型不僅在臨床發(fā)病表現(xiàn)上與MS類似，也在病理表現(xiàn)上存在與MS相契合的現(xiàn)象，這些現(xiàn)象也進(jìn)一步證實(shí)PLP誘導(dǎo)的EAE模型適用于MS的研究。

目前，針對(duì)MS的治療主要是減輕疾病嚴(yán)重程度，減少或延緩神經(jīng)功能殘疾的發(fā)生，降低復(fù)發(fā)率。但迄今為止尚無理想的治療方案可治愈MS或完全阻止疾病的發(fā)展及神經(jīng)功能殘疾加重，良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制、治療藥物研發(fā)都至關(guān)重要。PLP誘導(dǎo)的復(fù)發(fā)緩解型EAE小鼠不僅有助于驗(yàn)證各種受試藥物對(duì)疾病發(fā)病期的神經(jīng)功能改善作用，還有助于檢測受試藥物是否能夠延緩或降低疾病的復(fù)發(fā)率，更接近于臨床MS患者的實(shí)際發(fā)病情況。針對(duì)復(fù)發(fā)期時(shí)EAE小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的病理研究也將為MS復(fù)發(fā)期的發(fā)病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。