牛廣旭,郭曉娟,楊建華,劉小慧

(1邯鄲市中心醫(yī)院病理科,邯鄲 056001;2邯鄲市中心醫(yī)院普外二科;*通訊作者,E-mail:Niugx-HD@163.com)

肝癌指肝臟惡性腫瘤,其中原發(fā)性肝癌是指起源于肝臟上皮或間葉組織的肝臟惡性腫瘤,是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。肝癌的發(fā)病率和死亡率分別居第四和第三位,是我國(guó)高發(fā)且危害極大的惡性腫瘤[2]。肝癌的治療以手術(shù)為主,放療和化療為輔助。肝癌患者的5年生存率很低,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。原發(fā)性肝癌的病因及分子機(jī)制尚不完全清楚,嚴(yán)重限制了肝癌的預(yù)防和治療[3]。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)又稱腫瘤干樣細(xì)胞或者癌干細(xì)胞,是指腫瘤組織中具有干細(xì)胞性質(zhì)、能自我更新和無(wú)限增殖分化的細(xì)胞[4]。大量研究表明,實(shí)體瘤中存在罕見(jiàn)的干細(xì)胞亞群,對(duì)腫瘤治療的化療藥具有耐藥性,證實(shí)了腫瘤干樣細(xì)胞的存在。腫瘤干細(xì)胞的高自我更新能力使其能夠支持腫瘤治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[5]。研究顯示,肝癌干細(xì)胞在肝癌的耐藥和轉(zhuǎn)移中具有重要作用,抑制肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞干性能夠抑制肝癌的耐藥和轉(zhuǎn)移能力[6]。研究和開(kāi)發(fā)化療耐藥的轉(zhuǎn)移性肝癌的潛在靶向藥物成為肝癌治療的熱點(diǎn)。

細(xì)胞分裂周期蛋白6(cell division cycle 6,CDC6)是DNA復(fù)制的關(guān)鍵蛋白,能夠調(diào)控細(xì)胞分裂周期[7]。有研究表明,CDC6在腫瘤組織中高表達(dá),并且在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中有著潛在的作用,但具體機(jī)制不明[8]。本研究通過(guò)探討siRNA干擾CDC6表達(dá)對(duì)肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響,有助于更深入闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制,為肝癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)液(12491-015)和胎牛血清(FBS)(10099141)為美國(guó)Gibico公司產(chǎn)品,CDC6 siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒(SIGS0005915-4)購(gòu)自廣州銳博生物公司,lipofectamine 2000(11668019)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,wnt3a兔單克隆抗體(2721T)和β-catenin兔單克隆抗體(8480T)購(gòu)自美國(guó)CST公司,CDC6兔單克隆抗體(ab109315)購(gòu)自美國(guó)abcam公司。

1.2 HepG2-CSCs分離培養(yǎng)

取復(fù)蘇的HepG2細(xì)胞,加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2),正常換液和傳代。免疫磁珠法分選HepG2-CSCs:取對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞,消化離心后加入100 μl緩沖液制備成細(xì)胞懸液,加入20 μl CD133免疫磁珠,孵育1 h(4 ℃),應(yīng)用磁珠分選系統(tǒng)分選出CD133+細(xì)胞,所得CD133+HepG2即為肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs[9,10]。HepG2-CSCs置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定HepG2-CSCs

取分離的HepG2-CSCs,消化離心,然后加入100 μl緩沖液制備成細(xì)胞懸液,加入10 μl CD133-FITC抗體,4 ℃孵育1 h,離心取沉淀,PBS洗滌3次,加入300 μl PBS,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取HepG2-CSCs細(xì)胞接種于6孔板,按照Lipofectamine 2000操作說(shuō)明按比例將Lipofectamine 2000和CDC6 siRNA(對(duì)照siRNA)加入到細(xì)胞中,培養(yǎng)4-6 h,去除培養(yǎng)基,加入新鮮10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,常規(guī)培養(yǎng)24 h,然后用于后續(xù)Western blot、CCK8和細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染CDC6 siRNA(對(duì)照siRNA)的人肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs,消化離心,接種500個(gè)/孔的細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板,加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,常規(guī)培養(yǎng)14 d,實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞克隆數(shù),取細(xì)胞固定和Giesma染色,計(jì)算克隆形成率,克隆形成率=(克隆細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

取轉(zhuǎn)染CDC6 siRNA(對(duì)照siRNA)的人肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs種植于Transwell小室,加入DMEM培養(yǎng)基(不含血清),在24孔培養(yǎng)板中加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,加Transwell小室置于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,取出小室進(jìn)行細(xì)胞固定和Giesma染色,統(tǒng)計(jì)遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blot檢測(cè)wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)

取人肝癌細(xì)胞HepG2-CSCs以及轉(zhuǎn)染CDC6 siRNA和對(duì)照siRNA的HepG2-CSCs細(xì)胞,收集細(xì)胞蛋白樣品,定量后取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入1 ∶500稀釋的抗體CDC6、wnt3a和β-catenin,4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。洗滌3次,然后加入HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000稀釋),室溫孵育1 h,洗滌后顯色并拍照,進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析,所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。兩組間的比較采用t檢驗(yàn),多組間的比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepG2-CSCs的抗原標(biāo)記表達(dá)

首先通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了分離培養(yǎng)的HepG2-CSCs的免疫表型。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,CD133在HepG2和HepG2-CSCs中的表達(dá)率分別為(0.54±0.16)%和(98.82±0.95)%(見(jiàn)圖1)。表明本研究中分離的細(xì)胞為HepG2-CSCs,可用于后續(xù)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

與HepG2比較,**P<0.01圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2-CSCs的免疫表型Figure 1 The cell immunotype of HepG2-CSCs by flow cytometry

2.2 CDC6在HepG2-CSCs中高表達(dá)

檢測(cè)了肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs中CDC6蛋白表達(dá)水平,Western blot結(jié)果顯示,與HepG2細(xì)胞組相比,HepG2-CSCs組CDC6蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01,見(jiàn)圖2)。

與HepG2比較,**P<0.01圖2 CDC6在人肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs中的表達(dá)Figure 2 The expression of CDC6 in HepG2-CSCs

2.3 CDC6 siRNA抑制HepG2-CSCs克隆形成能力

CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照siRNA組比較,CDC6 siRNA組HepG2-CSCs細(xì)胞克隆形成能力顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照siRNA比較,**P<0.01圖3 CDC6 siRNA對(duì)肝癌HepG2-CSCs克隆形成能力的影響Figure 3 Effects of CDC6 siRNA on clone formation ability of HepG2-CSCs

2.4 CDC6 siRNA抑制HepG2-CSCs遷移能力

Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照siRNA組比較,CDC6 siRNA組肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs細(xì)胞遷移數(shù)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖4)。

圖4 CDC6 siRNA對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2-CSCs遷移能力的影響Figure 4 Effects of CDC6 siRNA on migration ability of HepG2-CSCs

2.5 CDC6 siRNA抑制wnt/β-catenin通路

Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照siRNA組相比,CDC6 siRNA組細(xì)胞CDC6、wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01,見(jiàn)圖5)。

與對(duì)照siRNA比較,**P<0.01圖5 CDC6 siRNA對(duì)肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs細(xì)胞wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects of CDC6 siRNA on the expression of wnt/β-catenin pathway-related proteins in HepG2-CSCs

3 討論

肝膽系統(tǒng)惡性腫瘤(主要是肝癌和膽管癌)的全球發(fā)病率日益增加[11]。肝癌在全球所有主要惡性腫瘤中的死亡率居第三位[12]。手術(shù)切除,經(jīng)皮消融和肝移植是肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,但這些僅適用于一小部分早期疾病患者[13]。因此,開(kāi)發(fā)針對(duì)肝癌的新型治療策略勢(shì)在必行。

高復(fù)發(fā)率和異質(zhì)性是肝細(xì)胞癌的兩個(gè)主要特征[14]。最近的研究表明,具有自我更新和分化能力的肝癌干細(xì)胞位于腫瘤體內(nèi),是造成肝細(xì)胞癌起始、進(jìn)展、抗藥性和腫瘤細(xì)胞分層組織的原因[15]。此外,基于腫瘤干細(xì)胞理論,肝癌干細(xì)胞的存在可能與肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后具有相關(guān)性。有研究顯示,一些肝癌干細(xì)胞的標(biāo)志物,如CD133和EpCAM的表達(dá)與腫瘤血管生成、化療耐藥以及肝癌患者總體預(yù)后差有關(guān)[16]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)肝癌干細(xì)胞水平高的肝癌患者的復(fù)發(fā)率高于肝癌干細(xì)胞水平較低的患者[17]。因此,肝癌干細(xì)胞一些標(biāo)志物的表達(dá)及其特殊性質(zhì)可以作為肝癌患者潛在預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

CD133是胚胎、骨髓及造血干細(xì)胞的特異性表明標(biāo)記物,也是最重要的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物,已經(jīng)在肺癌、肝癌和前列腺癌等腫瘤組織中得到證實(shí)[18]。有研究顯示,CD133陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞具有強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[19]。本研究通過(guò)免疫磁珠法從肝癌細(xì)胞株HepG2中成功分離出肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs,流式檢測(cè)顯示HepG2-CSCs表面標(biāo)志物CD133的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)98%。研究證實(shí)了CDC6在肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs中高表達(dá),CDC6 siRNA能夠顯著抑制HepG2-CSCs克隆形成和遷移能力,提示CDC6可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

細(xì)胞分裂周期蛋白6(cell division cycle 6,CDC6)是DNA復(fù)制的必需調(diào)節(jié)因子,并且在細(xì)胞周期中檢查點(diǎn)機(jī)制的激活和維持中起重要作用[20]。CDC6在DNA復(fù)制的早期階段起到調(diào)節(jié)劑的作用,它在細(xì)胞周期G1期間定位于細(xì)胞核中,組裝預(yù)復(fù)制復(fù)合物以啟動(dòng)G1期DNA復(fù)制,在S期開(kāi)始時(shí)易位至細(xì)胞質(zhì),但是相當(dāng)大比例的CDC6仍然存在于細(xì)胞核中執(zhí)行其他功能[21]。研究顯示,CDC6與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān),CDC6可作為轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制抑癌基因的轉(zhuǎn)錄,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后[22]。CDC6與肝癌干細(xì)胞之間的聯(lián)系還沒(méi)有研究證實(shí),基于上述研究結(jié)果和CDC6在癌癥中的調(diào)控作用,我們推測(cè)CDC6可能影響肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性從而影響肝癌的耐藥和轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)siRNA干擾CDC6的表達(dá),證實(shí)CDC6 siRNA能夠顯著抑制肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs的克隆形成能力,并且能夠抑制其遷移能力。證實(shí)了CDC6與肝癌干細(xì)胞克隆形成和遷移能力之間的聯(lián)系。

Wnt基因最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)并作用于胚胎發(fā)育,經(jīng)典Wnt信號(hào)通路又稱Wnt/β-catenin信號(hào)通路,是一條在生物進(jìn)化中極為保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[23]。在正常的細(xì)胞中,β-catenin與E-cadherin形成蛋白復(fù)合體,在維持細(xì)胞的黏附、抑制細(xì)胞的遷移中發(fā)揮重要作用[24]。當(dāng)細(xì)胞外Wnt信號(hào)分子與其受體結(jié)合,β-catenin在胞質(zhì)中積累起來(lái),積累的β-catenin轉(zhuǎn)移到核內(nèi),從而激活一系列基因的表達(dá),從而調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖和遷移等生物過(guò)程[25]。大量研究顯示,Wnt/β-catenin信號(hào)通路不但參與干細(xì)胞自我更新的調(diào)節(jié),并能通過(guò)多種方式調(diào)控基因的表達(dá)而作用于不同分化階段的干細(xì)胞[26-28]。本研究推測(cè)CDC6可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性。本研究顯示,CDC6 siRNA在抑制肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs克隆形成和遷移的同時(shí),能夠顯著抑制細(xì)胞wnt3a和β-catenin的蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步證實(shí)了先前的推測(cè)。但是CDC6是如何調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

綜上所述,本研究證實(shí)了CDC6在肝癌干細(xì)胞HepG2-CSCs中高表達(dá),CDC6 siRNA能夠抑制HepG2-CSCs克隆形成和遷移能力,并且可以顯著抑制肝癌干細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路,其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本課題研究有助于闡明CDC6在肝癌干細(xì)胞中的作用,為肝癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。