劉 偉,寇 博

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院血管外科,西安 710061;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;*通訊作者,E-mail:492526094@qq.com)

腎細(xì)胞癌在人類所有腫瘤中占2%-3%,而在西方國(guó)家中是第九大最為常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。過(guò)去的20多年里,腎癌的發(fā)病率呈2%的增長(zhǎng)[2]。盡管新的治療手段在不斷地提高腎癌患者的生存期,但多數(shù)患者最終會(huì)進(jìn)展為抵抗型腎細(xì)胞癌。因此,探尋有效的診斷性分子標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)顯得極為重要。

高遷移率族蛋白A2(HMGA2)屬于高遷移率族蛋白家族中的一員,是一種非組蛋白染色質(zhì)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)HMGA2在正常組織中少有表達(dá),但在喉癌、肺癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)[3,4]。文獻(xiàn)報(bào)道,HMGA2可參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種生物學(xué)行為[5-7]。而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的特征之一,是多個(gè)信號(hào)通路參與調(diào)控,使上皮細(xì)胞特性喪失并獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性的復(fù)雜過(guò)程。本研究基于Cancer Browser數(shù)據(jù)庫(kù)分析HMGA2在腎癌中的表達(dá)及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)的關(guān)系,進(jìn)而為闡明HMGA2在腎癌進(jìn)程中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

本研究通過(guò)檢索Cancer Browser數(shù)據(jù)庫(kù),檢索“renal cell carcinoma”,提取有關(guān)腎癌的臨床數(shù)據(jù)及基因表達(dá)(TCGA-KIRC-exp-HiSeqV2-2015-02-24),檢索關(guān)鍵詞“HMGA2”,提取HMGA2在腎癌中表達(dá)的數(shù)據(jù),并通過(guò)GraphPad 6.0軟件分析HMGA2與腎癌的TNM、Stage分期之間的關(guān)系。

1.2 臨床資料

選取了2019年3月住院的兩名腎癌患者,兩位患者年齡分別為53歲和58歲,術(shù)前檢查未合并其他實(shí)質(zhì)臟器腫瘤或感染性疾病,兩名患者入院后均行后腹腔鏡下腎癌根治術(shù),術(shù)后病理檢查提示為腎癌。取部分腎癌組織及癌旁正常組織各一塊,儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。所有材料的取用均?jīng)患者及家屬知情同意,并簽署相關(guān)知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和主要試劑

人腎小管上皮細(xì)胞HK2、胚胎腎293T細(xì)胞、腎癌786-O、769-P、SW839細(xì)胞系為西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室所有,1640-DF12培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,單克隆抗體HMGA2、Twist1、Twist2、Zeb1、Zeb2和β-actin購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,PCR引物、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。

腎小管上皮細(xì)胞和腎癌細(xì)胞均用含10%胎牛血清的1640-DF12培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基內(nèi)含青霉素(100 U/ml)及鏈霉素(100 U/ml),常規(guī)在37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞每隔2-3 d換液、傳代。

1.4 Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白及HMGA2蛋白的表達(dá)

腫瘤組織或細(xì)胞經(jīng)PBS緩沖液清洗后,用RIPA裂解液裂解組織或細(xì)胞。充分裂解離心后提取上清液,并進(jìn)行蛋白定量。隨后取20 μg變性蛋白樣品作聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)轉(zhuǎn)膜和脫脂奶粉封閉后,分別加入HMGA2、Twist1、Twist2、Zeb1、Zeb2、β-actin蛋白一抗(稀釋比例均為1 ∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜。經(jīng)TBST液洗脫后,室溫下孵育二抗(稀釋比例1 ∶1 000)。再次TBST液洗脫后,顯影液(美國(guó)Bio-Rad公司)顯影,利用Image Lab成像軟件(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行分析。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HMGA2的mRNA水平

腫瘤組織或者細(xì)胞通過(guò)TRIzol法提取總RNA,經(jīng)RNA定量后利用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。PCR擴(kuò)增所需引物自行設(shè)計(jì)后,由日本Takara公司合成。引物序列為HMGA2正義5′-ACCCAGGGGAAGACCCAAA-3′,反義5′-CCTCTTGGCCGTTTTTCTCCA-3′;β-actin正義5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,反義5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)BioRad CFXManager軟件定量分析。

1.6 采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲低靶基因

取兩個(gè)無(wú)酶EP管,分別加入100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基,然后1個(gè)EP管內(nèi)加入2 μg敲低HMGA2質(zhì)粒,另1個(gè)EP管內(nèi)加入8 μl X-tremeGENE DNA轉(zhuǎn)染試劑,充分混勻后靜置5 min,再將兩個(gè)EP管內(nèi)混液混勻后靜置15 min,然后將混液加至含293T細(xì)胞的6孔板內(nèi),將上述293T細(xì)胞在細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,隨后提取蛋白為后續(xù)的Western blot實(shí)驗(yàn)做前期準(zhǔn)備。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Cancer Browser數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果

通過(guò)Cancer Browser數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析,發(fā)現(xiàn)隨著腎癌的T、N、M分期的逐漸增高,HMGA2的表達(dá)亦顯著增高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖1);隨后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HMGA2的表達(dá)與腎癌的Stage分期也呈正相關(guān)關(guān)系,兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1圖1 Cancer Browser數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析HMGA2表達(dá)與腎癌的TNM、Stage分期之間的關(guān)系Figure 1 Relationship between the expression of HMGA2 and TNM, stage classification of renal cell carcinoma by Cancer Browser database

2.2 HMGA2在腎癌組織及細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示HMGA2在腎癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織,且實(shí)時(shí)定量PCR顯示腎癌組織中HMGA2的mRNA水平亦顯著高于癌旁正常組織(見(jiàn)圖2)。隨后進(jìn)一步通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在多種腎癌細(xì)胞內(nèi)HMGA2的表達(dá)顯著高于其在正常腎小管上皮細(xì)胞HK2內(nèi)的表達(dá),且實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果與之一致(見(jiàn)圖2)。這說(shuō)明HMGA2在腎癌中呈高表達(dá)。

圖2 HMGA2在腎癌組織及細(xì)胞內(nèi)的蛋白和mRNA表達(dá)Figure 2 The protein and mRNA levels of HMGA2 in the renal cell carcinoma tissues and cell lines

2.3 HMGA2與EMT指標(biāo)的相關(guān)性

通過(guò)Cancer Browser數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析,我們前期發(fā)現(xiàn)HMGA2與Twist1、Twist2呈正相關(guān)關(guān)系[8]。本研究中分析發(fā)現(xiàn)HMGA2與Zeb1、Zeb2的表達(dá)之間無(wú)明顯的相關(guān)性(見(jiàn)圖3)。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在腎癌患者的腫瘤組織中Twist1、Twist2和HMGA2均呈高表達(dá),而Zeb1和Zeb2的表達(dá)無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖3)。而相較于正常腎小管上皮細(xì)胞HK2,腎癌細(xì)胞786-O內(nèi)Twist1、Twist2和HMGA2均呈高表達(dá),而Zeb1和Zeb2亦無(wú)顯著改變(見(jiàn)圖3)。

圖3 HMGA2與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)指標(biāo)在腎癌中的相關(guān)性Figure 3 Correlations between HMGA2 and EMT-related markers in the renal cell carcinoma

2.4 HMGA2對(duì)腎癌細(xì)胞內(nèi)EMT指標(biāo)的影響

通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低HMGA2可在腎癌細(xì)胞內(nèi)抑制Twist1和Twist2的蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖4);隨后的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果亦證實(shí)HMGA2的敲低可下調(diào)Twist1和Twist2的mRNA表達(dá)(見(jiàn)圖4)。

圖4 敲低HMGA2對(duì)腎癌細(xì)胞786-O內(nèi)Twist1和Twist2的影響Figure 4 Effect of HMGA2 knockdown on Twist1 and Twist2 of human renal cell carcinoma 786-O cells

3 討論

HMGA2作為一種轉(zhuǎn)錄因子,其自身不具備轉(zhuǎn)錄活性,但其包含有3個(gè)AT-hook結(jié)構(gòu),能夠結(jié)合于DNA上的AT序列富集區(qū)域,進(jìn)而調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)。HMGA2在成人的正常組織中少有表達(dá),而在腫瘤組織中呈高表達(dá),且影響腫瘤的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)HMGA2可促進(jìn)乳腺癌的惡性進(jìn)程[9]。也有文獻(xiàn)報(bào)道,HMGA2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中可促進(jìn)其侵襲及不良預(yù)后[10]。這說(shuō)明HMGA2在腫瘤中扮演著促癌基因的角色。本研究通過(guò)Cancer Browser數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)HMGA2的表達(dá)與腎癌的TNM分期、Stage分期呈正相關(guān)關(guān)系,且兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示HMGA2在腎癌的進(jìn)程中起著重要作用。

而研究顯示,在腎癌ACHN細(xì)胞內(nèi),HMGA2的敲低可抑制其增殖和侵襲能力[11]。且Na等[12]學(xué)者發(fā)現(xiàn)HMGA2的高表達(dá)常常提示腎透明細(xì)胞癌的不良預(yù)后。為了進(jìn)一步明確HMGA2在腎癌中的表達(dá),通過(guò)Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)HMGA2在腎癌組織及細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織及正常腎小管上皮細(xì)胞。這提示HMGA2在腎癌中可能是一個(gè)促癌基因。而新近研究報(bào)道HMGA2與腫瘤的侵襲遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有著緊密關(guān)聯(lián)[13]。Sun等[14]學(xué)者發(fā)現(xiàn)HMGA2可通過(guò)調(diào)控Twist1促進(jìn)胃癌的侵襲進(jìn)程。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)沉默HMGA2可抑制前列腺癌的侵襲遷移能力[15]。而新近研究報(bào)道HMGA2可以通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smad2信號(hào)通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[15]。本研究則通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不管在腎癌組織還是在腎癌細(xì)胞內(nèi),HMGA2與Twist1、Twist2均呈高表達(dá),而Zeb1和Zeb2的表達(dá)無(wú)明顯變化。這說(shuō)明HMGA2與腎癌的侵襲轉(zhuǎn)移尤其是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)Twist1、Twist2關(guān)系密切。隨后我們進(jìn)一步通過(guò)敲低HMGA2發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞內(nèi)Twist1和Twist2的表達(dá)水平明顯下調(diào)。這提示HMGA2可在腎癌細(xì)胞內(nèi)正向調(diào)控Twist1和Twist2的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞內(nèi)HMGA2可通過(guò)靶向作用于Twist1進(jìn)而調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程,因此HMGA2在腎癌細(xì)胞中如何調(diào)控Twist1和Twist2是后續(xù)研究的重點(diǎn)[7]。

總而言之,基于Cancer Browser數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)HMGA2與腎癌的TNM分期、Stage分期呈正相關(guān)。而通過(guò)一系列細(xì)胞生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HMGA2在腎癌組織及細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá),且HMGA2可正向調(diào)控Twist1和Twist2的表達(dá)。