王路明,姜慶生,左艷萍,唐成芳

(1西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院口腔科,西安 710038;2西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科;3西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:wlmxayxy@126.com)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是頭頸癌中的常見病理類型之一[1]。在過去的幾十年中,盡管手術(shù)、化療和放療等治療措施不斷進(jìn)展,但OSCC患者的5年生存率依舊較低,約為50%-60%[2]。臨床和基礎(chǔ)研究表明,OSCC細(xì)胞已經(jīng)對臨床常規(guī)化療藥物產(chǎn)生了耐藥[3]。因此,亟需尋找新的有效藥物用于預(yù)防或延緩OSCC的發(fā)展。

補(bǔ)骨脂酚(bakuchiol,BAK)是一種從補(bǔ)骨脂種子中分離出的異戊烯化酚類單萜,是常用于治療哮喘、腹瀉和骨質(zhì)疏松癥等疾病的傳統(tǒng)中藥[4-6]。補(bǔ)骨脂酚可通過JNK激活Caspase-3,促進(jìn)Bax易位到線粒體,誘發(fā)大鼠肝臟肌成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。補(bǔ)骨脂酚可通過誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞S期阻滯、Caspase-3/9活化、p53和Bax上調(diào)以及Bcl-2下調(diào)發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。我們課題組前期研究首次證實(shí),補(bǔ)骨脂酚能夠有效抑制OSCC的增殖和轉(zhuǎn)移,但其具體下游分子機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明[8]。SIRT3是線粒體內(nèi)最主要的去乙?；?可通過去乙?；揎椌€粒體內(nèi)多種蛋白(如超氧化物歧化酶2,SOD2),參與調(diào)節(jié)線粒體三羧酸循環(huán)、能量轉(zhuǎn)化和氧化應(yīng)激等病理生理過程[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)骨脂酚多種藥理作用的發(fā)揮與線粒體功能密切相關(guān)[10,11],據(jù)此我們推測補(bǔ)骨脂酚可能是通過調(diào)節(jié)SIRT3/SOD2信號通路發(fā)揮抗OSCC作用。因此,本研究旨在觀察補(bǔ)骨脂酚對OSCC細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激及遷移的影響,并探究SIRT3/SOD2信號通路是否介導(dǎo)補(bǔ)骨脂酚的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

補(bǔ)骨脂酚(貨號:68612)、細(xì)胞核染料DAPI(貨號:D9542)和二甲基亞砜(DMSO,貨號:D2650)購自Sigma-Aldrich公司;抗Bax(貨號:2772,20 kD)、Bcl-2(貨號:3498,26 kD)和cleaved Caspase-3(貨號:9661,17 kD)抗體購自Cell Signaling Technology公司;抗Ac-SOD2(貨號:ab137037,24 kD)、SOD2(貨號:ab13533,25 kD)和SIRT3(貨號:ab118334,29 kD)抗體購自Abcam公司;抗β-actin(貨號:4E8H3,43 kD)抗體購自Santa Cruz公司;原位末斷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)試劑盒購自Roche公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;SIRT3過表達(dá)腺病毒和空載體腺病毒購自漢恒生物科技(上海)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

OSCC細(xì)胞系購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。將OSCC細(xì)胞分為4組:①正常OSCC細(xì)胞(control)組:將OSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體腺病毒24 h,然后再用無血清DMEM培養(yǎng)24 h;②補(bǔ)骨脂酚(BAK)組:將OSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體腺病毒24 h,然后用補(bǔ)骨脂酚處理24 h;③腺病毒過表達(dá)SIRT3+補(bǔ)骨脂酚(SIRT3-AV+BAK)組:將OSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT3過表達(dá)腺病毒24 h,繼而補(bǔ)骨脂酚處理24 h;④腺病毒過表達(dá)SIRT3(SIRT3-AV)組:將OSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT3過表達(dá)腺病毒24 h,然后再用無血清DMEM培養(yǎng)24 h。補(bǔ)骨脂酚的給藥劑量為5 μmol/L,該劑量的選擇參考本課題組以往發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)[8]。本研究中使用的腺病毒滴度為1×1010PFU/ml。

1.3 細(xì)胞活力測定

將OSCC細(xì)胞以每孔104個(gè)細(xì)胞的濃度接種在96孔培養(yǎng)板中;各組細(xì)胞藥物處理結(jié)束后,每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml),將細(xì)胞在37 ℃下進(jìn)一步孵育4 h;除去培養(yǎng)基,每孔加入150 μl的DMSO并充分震蕩5 min;用ELISA酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測各組細(xì)胞吸光度。細(xì)胞活力的檢測結(jié)果表示為相對于control組吸光度值的百分比。

1.4 細(xì)胞凋亡率檢測

采用TUNEL染色檢測各組OSCC細(xì)胞凋亡率。凋亡率=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。具體操作參考以往文獻(xiàn)[8]。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測

將各組OSCC細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的濃度接種在六孔板中;當(dāng)細(xì)胞基本匯合后,吸出細(xì)胞培養(yǎng)基;用同一移液槍頭(10 μl)進(jìn)行劃痕;用PBS洗滌細(xì)胞3次;用無血清DMEM處理細(xì)胞24 h;用倒置顯微鏡(Olympus公司)自帶相機(jī)對各組細(xì)胞劃痕進(jìn)行拍照并計(jì)算劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距。各組OSCC細(xì)胞的細(xì)胞間距以control組的相對值來表示。

1.6 活性氧產(chǎn)量檢測

細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測方法參考以往文獻(xiàn)[12]。簡言之,將OSCC細(xì)胞(1×104)接種于96孔板,然后進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染和BAK等處理;BAK處理24 h后,將細(xì)胞與10 μmol/L 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)一步共處理20 min;用DMEM洗滌細(xì)胞3次后向每孔加入100 μl無血清DMEM;用SpectraMax M5(Molecular Devices公司)分光光度儀測量各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為525 nm。

1.7 蛋白表達(dá)檢測

用CelLyticTMM細(xì)胞裂解液(Sigma-Aldrich公司)裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白質(zhì);通過Bradford方法定量蛋白質(zhì)濃度;通過10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并電轉(zhuǎn)到PVDF膜上;將PVDF膜在5%脫脂牛奶中室溫孵育1.5 h;將抗SIRT3、Ac-SOD2、SOD2、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3和β-actin抗體以1 ∶1 000稀釋,在4 ℃下與PVDF膜孵育過夜;TBST洗膜3次,每次10 min;將辣根過氧化物酶HPR-標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)與PVDF膜孵育1 h;TBST洗膜3次,每次10 min;使用Fusion SL成像系統(tǒng)(Viber Lourmat公司)檢測和分析蛋白表達(dá)情況。β-actin作為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BAK和SIRT3-AV對OSCC細(xì)胞SIRT3信號通路的影響

與control組相比,BAK組細(xì)胞中SIRT3的表達(dá)下降,而SOD2的乙?；教岣?P<0.05)。與control組相比,SIRT3-AV組SIRT3的表達(dá)量明顯上升,而SOD2的乙?；矫黠@下降(P<0.05)。此外,與BAK組相比,SIRT3-AV+BAK組OSCC細(xì)胞內(nèi)SIRT3的表達(dá)量也明顯上升,而SOD2的乙?；矫黠@下降(P<0.05,見圖1)。

與control組相比,#P<0.05;與BAK組相比,*P<0.05圖1 Western blot檢測補(bǔ)骨脂酚對OSCC細(xì)胞SIRT3信號通路的影響 (n=4)Figure 1 The effect of bakuchiol on the SIRT3 signaling pathway in OSCC cells by Western blot (n=4)

2.2 補(bǔ)骨脂酚和SIRT3-AV對OSCC細(xì)胞增殖和氧化應(yīng)激水平的影響

與control組相比,BAK組OSCC細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)。與BAK組相比,SIRT3-AV+BAK組OSCC細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯提高(P<0.05)。SIRT3-AV組OSCC細(xì)胞的細(xì)胞活力與control組細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與control組細(xì)胞相比,BAK組OSCC細(xì)胞的ROS產(chǎn)量明顯增高(P<0.05)。與BAK組相比,SIRT3-AV+BAK組OSCC細(xì)胞的ROS產(chǎn)量明顯降低(P<0.05)。SIRT3-AV組OSCC細(xì)胞的ROS產(chǎn)量與control組細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖2)。

與control組相比,#P<0.05;與BAK組相比,*P<0.05圖2 補(bǔ)骨脂酚和SIRT3-AV對OSCC細(xì)胞活力和活性氧產(chǎn)量的影響 (n=4)Figure 2 The effects of bakuchiol and SIRT3-AV on the cell viability and ROS production of OSCC cells (n=4)

2.3 補(bǔ)骨脂酚和SIRT3-AV對OSCC細(xì)胞凋亡的影響

與control組相比,BAK組OSCC細(xì)胞的凋亡率(TUNEL染色陽性率)明顯增高(P<0.05)。與BAK組相比,SIRT3-AV+BAK組OSCC細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P<0.05)。SIRT3-AV組OSCC細(xì)胞的凋亡率與control組細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖3)。此外,我們檢測了促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)以及Caspase-3的活化情況。與control組相比,BAK組OSCC細(xì)胞Bax和cleaved Caspase-3的表達(dá)量明顯增加,而Bcl-2的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與BAK組相比,SIRT3-AV+BAK組OSCC細(xì)胞Bax和cleaved Caspase-3的表達(dá)量明顯降低,而Bcl-2的表達(dá)量明顯增高(P<0.05)。與control組相比,單純上調(diào)SIRT3表達(dá)對于OSCC細(xì)胞Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的表達(dá)無明顯影響(P>0.05,見圖4)。

圖3 補(bǔ)骨脂酚和SIRT3-AV對OSCC細(xì)胞凋亡率的影響 (n=4)Figure 3 The effects of bakuchiol and SIRT3-AV on apoptotic ratio in OSCC cells (n=4)

1.control組;2.BAK組;3.SIRT3-AV+BAK組;4.SIRT3-AV組;與control組相比,#P<0.05;與BAK組相比,*P<0.05圖4 Western blot檢測補(bǔ)骨脂酚和SIRT3-AV對OSCC細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (n=4)Figure 4 The effects of bakuchiol and SIRT3-AV on the expression of apoptosis-related proteins in OSCC cells by Western blot (n=4)

2.4 補(bǔ)骨脂酚和SIRT3-AV對OSCC細(xì)胞遷移的影響

與control組相比,BAK組細(xì)胞間距明顯增加(P<0.05)。與BAK組相比,SIRT3-AV+BAK組細(xì)胞間距明顯降低(P<0.05)。與control組相比,SIRT3-AV組OSCC的細(xì)胞間距差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖5)。

圖5 補(bǔ)骨脂酚和SIRT3-AV對OSCC細(xì)胞遷移能力的影響 (n=4)Figure 5 The effects of bakuchiol and SIRT3-AV on the migration of OSCC cells (n=4)

3 討論

由于口腔鱗狀細(xì)胞癌患者5年生存率仍然很低,因此需要研發(fā)新的有效治療方法用于干預(yù)口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[2]。補(bǔ)骨脂酚是一種從補(bǔ)骨脂種子中分離出的異戊烯化酚類單萜。補(bǔ)骨脂酚是白藜蘆醇的類似物之一,而白藜蘆醇是潛在的強(qiáng)效抗癌藥物之一[13]。據(jù)報(bào)道,白藜蘆醇能夠誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,包括SW480、MCF7、HCE7、Seg-1、HL60和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞等[14,15]。與白藜蘆醇相似的是,最新研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)骨脂酚也可用于治療多種類型的腫瘤。Park等[16]證實(shí),補(bǔ)骨脂酚通過激活ROS/JNK途徑信號上調(diào)DR4和DR5受體表達(dá)促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。Kim等[17]證實(shí),補(bǔ)骨脂酚可靶向結(jié)合并調(diào)節(jié)Hck、Blk和p38 MAPK,抑制皮膚癌細(xì)胞增殖。本課題組前期研究證實(shí),補(bǔ)骨脂酚能有效抵抗OSCC細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究[8]。本研究的結(jié)果表明,補(bǔ)骨脂酚可通過抑制SIRT3的表達(dá),降低OSCC細(xì)胞的細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡,誘導(dǎo)過量ROS的產(chǎn)生,降低OSCC細(xì)胞的遷移能力,從而發(fā)揮抗OSCC發(fā)生發(fā)展的作用。

SIRT3是線粒體內(nèi)最主要的去乙?；?參與調(diào)節(jié)線粒體能量代謝、氧化應(yīng)激等病理生理過程[18]。大量研究證實(shí)SIRT3與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展息息相關(guān),但其具體作用因腫瘤類型的不同而不同。一些研究人員認(rèn)為,SIRT3可通過調(diào)節(jié)線粒體抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中的關(guān)鍵蛋白,抑制腫瘤細(xì)胞線粒體內(nèi)過量ROS的產(chǎn)生,抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖,從而促進(jìn)某些類型癌癥的發(fā)生發(fā)展。例如在乳腺癌中,降低SIRT3的表達(dá)可以通過誘導(dǎo)過量ROS的產(chǎn)生,增加乳腺癌細(xì)胞對于化療的敏感性[19]。在膀胱癌細(xì)胞中,p53可以導(dǎo)致癌細(xì)胞生長抑制和凋亡,而SIRT3可以與p53結(jié)合并使其去乙?；?導(dǎo)致p53活性降低[20]。在胃癌細(xì)胞中,過表達(dá)SIRT3促進(jìn)細(xì)胞增殖,增加細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量,促進(jìn)葡萄糖攝取和糖原形成,提示SIRT3可能在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[21]。此外,在黑色素瘤細(xì)胞中,抑制SIRT3表達(dá)可抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、集落形成和遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,引起G1期停滯;而過表達(dá)SIRT3能明顯促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖[22]。與之相反的是,一些研究表明SIRT3具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。SIRT3通過去乙?；揎桯IF-1α、Bcl-2和p53等蛋白,誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[23,24]。在宮頸癌細(xì)胞中,Vosaroxin可通過激活A(yù)MPK/SIRT3信號通路,降低HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力,增加乳酸脫氫酶的釋放,增加線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)量,促進(jìn)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成,降低細(xì)胞內(nèi)ATP的合成[25]。過表達(dá)SIRT3可以抑制乳腺癌細(xì)胞中的糖酵解和增殖,從而抑制腫瘤細(xì)胞能量代謝[23]。在裸鼠異種移植模型中,SIRT3基因敲除的腫瘤細(xì)胞比對照組腫瘤細(xì)胞生長更快并且體積更大[26]。在肝細(xì)胞癌中,SIRT3可抑制HepG2細(xì)胞的生長和增殖,誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡,其機(jī)制可能與SIRT3上調(diào)SOD和p53活性,進(jìn)而上調(diào)Bax和Fas的表達(dá)有關(guān)[27]。在B細(xì)胞性惡性淋巴瘤中,上調(diào)SIRT3可以通過去乙?；悪幟仕崦摎涿?和SOD2抑制腫瘤細(xì)胞增殖[28]。特別值得注意的是,Alhazzazi等[29]證實(shí),與正常口腔角質(zhì)細(xì)胞相比,SIRT3在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中表達(dá)量明顯增加。下調(diào)SIRT3表達(dá)可明顯抑制OSCC細(xì)胞生長和增殖,并增加OSCC細(xì)胞對放射線治療和順鉑治療的敏感性。

在本研究中,為明確SIRT3是否介導(dǎo)BAK抗口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用,我們通過補(bǔ)骨脂酚(5 μmol/L)處理OSCC細(xì)胞,并檢測了SIRT3/SOD2信號通路的表達(dá)情況。補(bǔ)骨脂酚給藥劑量與本課題組先前研究[8]一致。我們發(fā)現(xiàn),補(bǔ)骨脂酚明顯降低OSCC細(xì)胞內(nèi)SIRT3的表達(dá)量,繼而增加SIRT3下游靶蛋白SOD2的乙?；?。以往研究表明,SIRT3可以與Ku70蛋白相互作用,對Ku70進(jìn)行去乙?；揎?進(jìn)而參與細(xì)胞DNA修復(fù),抑制細(xì)胞凋亡[30]。此外,激活SIRT3還可以通過去乙酰化修飾SOD2,抑制ROS產(chǎn)生,抑制細(xì)胞凋亡[12]。與此相一致的是,補(bǔ)骨脂酚處理后OSCC細(xì)胞內(nèi)SIRT3信號通路的抑制伴隨ROS產(chǎn)量、促凋亡蛋白Bax和cleaved Caspase-3表達(dá)量以及細(xì)胞凋亡率明顯增加,而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯降低。此外,SIRT3信號通路的受損也伴隨OSCC細(xì)胞遷移能力的明顯降低。為了證明補(bǔ)骨脂酚是否通過抑制SIRT3信號通路發(fā)揮上述保護(hù)作用,我們通過腺病毒上調(diào)OSCC細(xì)胞內(nèi)SIRT3的表達(dá)水平。與control組相比,單純過表達(dá)SIRT3(SIRT3-AV組)對于OSCC細(xì)胞的細(xì)胞活力、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的表達(dá)、凋亡率以及遷移能力均無明顯影響。但與BAK組相比,SIRT3-AV+BAK組OSCC細(xì)胞內(nèi)Bax和cleaved Caspase 3的表達(dá)量、ROS產(chǎn)量、凋亡率明顯降低,而細(xì)胞遷移能力和Bcl-2的表達(dá)量明顯增加,即上調(diào)SIRT3表達(dá)可以明顯抑制補(bǔ)骨脂酚的抗腫瘤作用。

綜上所述,本研究證實(shí)補(bǔ)骨脂酚可通過抑制OSCC細(xì)胞增殖和遷移,誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷和凋亡,從而發(fā)揮抗OSCC發(fā)生發(fā)展的作用,且其抗腫瘤作用的發(fā)揮主要由SIRT3信號通路介導(dǎo)。本研究為臨床上應(yīng)用補(bǔ)骨脂酚治療OSCC提供了新的理論依據(jù)。