李中巖,李文媛,王 瑩,李雪花

(1阜新市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,阜新 123000;2牡丹江醫(yī)學(xué)院神經(jīng)組織工程研究所;3阜新市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:yingwang770224@163.com)

腦缺血/再灌注損傷是一種常見(jiàn)臨床疾病,在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致高致殘率和死亡率。腦缺血/再灌注損傷引起腦損傷能夠造成多種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,包括失語(yǔ)癥、偏癱和癡呆等[1-3]。然而,目前尚缺乏有效的治療手段。腦缺血再灌注損傷病理過(guò)程復(fù)雜,目前大量研究證實(shí)通過(guò)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)干預(yù)腦缺血/再灌注損傷可能是一種有前景的治療方法[4]。NGF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中最先發(fā)現(xiàn)的成員,NGF促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和維持細(xì)胞表型,保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿能神經(jīng)元功能完整性。但目前NGF臨床應(yīng)用仍然存在一些限制,包括NGF有害副作用和應(yīng)用復(fù)雜性[5]。

miRNAs是一組小的非編碼RNA,以轉(zhuǎn)錄后方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)。其通過(guò)與目的mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合,導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制。miRNAs通過(guò)靶向不同的基因及相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路,參與多種生理和病理過(guò)程[6]。大量研究表明miRNAs參與腦缺血/再灌注損傷的病理過(guò)程,并調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活和凋亡過(guò)程中各種關(guān)鍵基因的表達(dá),成為腦缺血/再灌注損傷新的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)[7]。因此探討miRNA分子表達(dá)和功能可以有效揭示腦缺血再灌注損傷的分子機(jī)制。

let-7d microRNAs(miRNAs)是let-7 miRNA家族成員。let-7 miRNA最初在秀麗隱桿線蟲(chóng)被發(fā)現(xiàn),其保存在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)let-7d能夠調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化、影響神經(jīng)變性和神經(jīng)元再生[8,9],抑制let-7能夠促進(jìn)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[10]。前期研究證實(shí),坐骨神經(jīng)損傷后let-7d通過(guò)直接靶向作用NGF,并抑制其蛋白翻譯,顯著降低雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)增殖和遷移[11],但在腦缺血再灌注損傷中l(wèi)et-7d對(duì)海馬神經(jīng)元的作用及調(diào)控機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。研究表明細(xì)胞調(diào)亡在腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元細(xì)胞的損傷和保護(hù)中發(fā)揮重要作用,通過(guò)氧糖剝奪與復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation and reoxygenation,OGD/R)模擬體內(nèi)的腦缺血再灌注病理生理過(guò)程,能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[12]。目前OGD/R海馬神經(jīng)元細(xì)胞模型被公認(rèn)為是最合適的體外模擬腦缺血的模型,常用于從細(xì)胞及分子水平研究腦缺血再灌注損傷的機(jī)制及藥物治療效果[3,6,7],因此本研究利用OGD/R技術(shù)誘導(dǎo)HT22海馬神經(jīng)元損傷模型,模擬“腦缺血”狀態(tài)。觀察轉(zhuǎn)染let-7d模擬物和抑制劑對(duì)OGD/R細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的作用,探討let-7d抑制劑對(duì)缺血再灌注損傷海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制,為臨床腦缺血再灌注損傷治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞系購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)、4.5 g/L葡萄糖和1%青霉素/鏈霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)HT22細(xì)胞(均購(gòu)自美國(guó)sigma公司)。

1.2 OGD/R細(xì)胞模型制備

將HT22細(xì)胞在無(wú)糖平衡鹽溶液中培養(yǎng)，在三氣缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(1% O2、94% N2、5% CO2、37 ℃)培養(yǎng)6 h，用含4.5 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基代替無(wú)糖平衡鹽溶液，在正常條件下復(fù)氧培養(yǎng)48 h制備OGD/R模型[1]。未經(jīng)OGD/R處理的細(xì)胞作為正常組，采用HT22細(xì)胞完全培養(yǎng)液、正常細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組

miRNA-NC、let-7d mimics和let-7d inhibitor購(gòu)自美國(guó)abm公司,應(yīng)用Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)按說(shuō)明書對(duì)OGD/R細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將細(xì)胞分為正常組、OGD/R+miRNA-NC組、OGD/R+let-7d mimics組和OGD/R+let-7d inhibitor組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

應(yīng)用Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)提取總RNA,并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄cDNA,U6作為let-7d內(nèi)參照,GAPDH作為NGF內(nèi)參照。反應(yīng)體系包括10 ml SYBR Green PCR Master Mix(美國(guó)Applied Biosystems公司)、2 ml引物(中國(guó)TaKaRa公司)和8 ml cDNA(德國(guó)Qiagen公司)。各引物序列為:let-7d上游5′-TGAGGTAGTAGTTTGTACAGTTTGAGG-3′,下游5′-GCAAGGCAGTGGCCTGTACAGTTATC-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。NGF上游5′-CCAAGGACGCAGCTTTCTATC-3′,下游5′-CTGTGTCAAGGGAATGCTGAAG-3′;GAPDH上游5′-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3′,下游5′-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3′。利用2-ΔΔCt方法分析。

1.5 細(xì)胞活性檢測(cè)

應(yīng)用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒,采用比色法測(cè)定細(xì)胞活力,即將各組細(xì)胞接種在96孔板中并培養(yǎng)過(guò)夜,每孔加入10 ml CCK-8溶液在37 ℃下培養(yǎng)2 h,在450 nm波長(zhǎng)應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

各組細(xì)胞接種在6孔板。加入1 ml Hoechst33342孵育0.5 h,應(yīng)用50 g/L PI孵育15 min,根據(jù)前期研究方法[13]在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)觀察,每組細(xì)胞于高倍鏡下隨機(jī)選取視野,計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)(每組不少于1 000個(gè)),計(jì)算凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R后let-7d表達(dá)降低

qRT-PCR結(jié)果表明,與正常組比較,let-7d mRNA在海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R后6,12,24 h表達(dá)顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001),在OGD/R后48 h,let-7d mRNA表達(dá)升高,與正常組無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖1)。

與正常組比較,*P<0.05,***P<0.001圖1 qRT-PCR檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R后let-7d mRNA表達(dá)Figure 1 The let-7d mRNA expression in hippocampal neurons after OGD/R by qRT-PCR

2.2 let-7d抑制劑降低OGD/R后海馬神經(jīng)元細(xì)胞let-7d表達(dá),升高NGF表達(dá)

與正常組比較,OGD/R+miRNA-NC組let-7d mRNA表達(dá)顯著降低。與OGD/R+miRNA-NC組比較,OGD/R+let-7d mimics組let-7d mRNA表達(dá)顯著增高,而OGD/R+let-7d inhibitor組顯著降低(F3,12=165.8,P<0.001)。與之相反,OGD/R+miRNA-NC組NGF mRNA表達(dá)較正常組顯著升高;與OGD/R+miRNA-NC組比較,OGD/R+let-7d mimics組NGF mRNA表達(dá)顯著降低,而OGD/R+let-7d inhibitor組NGF mRNA表達(dá)則顯著升高(F3,12=71.27,P<0.001,見(jiàn)圖2)。

與正常組比較，***P<0.001;與NC組比較，###P<0.001圖2 qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞let-7d和NGF mRNA相對(duì)表達(dá)Figure 2 The let-7d and NGF mRNA expression in hippocampal neurons in different groups by qRT-PCR

2.3 let-7d抑制劑逆轉(zhuǎn)OGD/R后海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性降低

與正常組比較,OGD/R+miRNA-NC組細(xì)胞活性顯著降低。與OGD/R+miRNA-NC組比較,OGD/R+let-7d mimics組細(xì)胞活性顯著降低,而OGD/R+let-7d inhibitor組顯著增高(F3,12=160.3,P<0.001,見(jiàn)圖3)。

2.4 let-7d抑制劑降低OGD/R后海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率

OGD/R+miRNA-NC組細(xì)胞凋亡率較正常組顯著增高。與OGD/R+miRNA-NC組比較,OGD/R+let-7d mimics組細(xì)胞凋亡率顯著增高,而OGD/R+let-7d inhibitor組則顯著降低(F3,12=188.0,P<0.001,見(jiàn)圖4)。

與正常組比較，***P<0.001;與NC組比較，###P<0.001圖3 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活性 (n=3)Figure 3 Cell viability in different groups by CCK8 assay (n=3)

A.正常組; B.OGD/R+miRNA-NC組; C.OGD/R+let-7d mimics組; D.OGD/R+let-7d inhibitor組圖4 Hoechst33342/PI雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡Figure 4 Cell apoptosis in different groups by Hoechst33342/PI double staining

3 討論

腦缺血/再灌注損傷是一個(gè)普遍存在的全球性臨床問(wèn)題,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量并造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),臨床治療促進(jìn)腦缺血/再灌注損傷神經(jīng)功能恢復(fù)效果有限。microRNAs是內(nèi)源性編碼保守的小RNAs(20-22堿基對(duì)),其主要通過(guò)促進(jìn)靶向mRNAs的降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNAs在神經(jīng)發(fā)育、變性和再生中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[14]。大量證據(jù)表明,miRNAs在腦缺血/再灌注損傷中表達(dá)失調(diào),并在調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7,15]。

let-7家族由13個(gè)成員組成,這些成員在物種間高度保守。它們共享相同的種子序列并靶向不同細(xì)胞類型的多個(gè)基因[8]。已知let-7家族的多種基因調(diào)控Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、血凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1)、Bcl-xl和AGO1等靶基因,在缺血性心臟病中發(fā)揮作用,降低心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡;抑制let-7c可改善心肌梗死后的心臟功能;上調(diào)let-7g可通過(guò)靶向pik3ip1(急性缺血再灌注損傷時(shí)Akt信號(hào)通路的抑制劑)保護(hù)心肌細(xì)胞免受凋亡[16]。上調(diào)let-7d可靶向NGF顯著降低施萬(wàn)細(xì)胞(Schwann cells,SCs)的增殖和遷移,抑制坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)[11],但let-7d在腦缺血再灌注損傷中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

let-7d是否參與細(xì)胞OGD/R損傷國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道,在本研究中首先評(píng)估let-7d在海馬神經(jīng)元OGD/R損傷后不同時(shí)間點(diǎn)let-7d的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示OGD/R損傷后6,12,24 h,海馬神經(jīng)元let-7d的表達(dá)顯著降低,48 h表達(dá)水平上調(diào),與對(duì)照組無(wú)顯著差異。表明let-7d可能是參與調(diào)節(jié)OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷的新型miRNA。前期研究證明,坐骨神經(jīng)損傷后let-7表達(dá)降低,并與NGF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。let-7表達(dá)降低能夠顯著促進(jìn)SCs分泌NGF,促進(jìn)SCs增殖和遷移,抑制SCs凋亡,對(duì)SCs具有顯著保護(hù)作用[11]。因此本研究推測(cè)OGD/R損傷后let-7d表達(dá)降低對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷具有同樣保護(hù)作用,let-7d表達(dá)下調(diào)可能是OGD/R損傷早期保護(hù)性反應(yīng),進(jìn)一步抑制let-7d表達(dá)可起到抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用。為證實(shí)這一假說(shuō),本研究首先探討OGD/R與海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),OGD/R組較正常組細(xì)胞活性顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著增高,再次證實(shí)OGD/R能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步檢測(cè)let-7d模擬物和抑制劑對(duì)細(xì)胞活力和凋亡的影響。結(jié)果表明let-7d抑制劑顯著降低OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,同時(shí)顯著增加細(xì)胞活性。而let-7d模擬物具有相反的效果。這些結(jié)果證實(shí)抑制let-7d對(duì)OGD/R處理的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

前期研究發(fā)現(xiàn),let-7d miRNA靶向NGF的作用與NGF對(duì)中樞神經(jīng)再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用一致[11]。NGF在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族中具有重要地位,其在周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元發(fā)育和存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。同時(shí)NGF能夠參與免疫和炎癥反應(yīng)[18]。目前重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(recombinant human nerve growth factor,rhNGF)在臨床上應(yīng)用最為廣泛,然而rhNGF對(duì)人體的副作用不容忽視,包括肌肉疼痛和注射部位痛覺(jué)過(guò)敏、半衰期短、不能跨越血腦屏障,以及高劑量時(shí)可能的致瘤性[5]。因此,通過(guò)神經(jīng)元細(xì)胞分泌NGF的內(nèi)源性調(diào)控可作為外源性NGF的治療提供替代方案?；谶@一考慮,本文研究了let-7d對(duì)海馬神經(jīng)元產(chǎn)生NGF的影響,結(jié)果表明與OGD/R+miRNA-NC組比較,OGD/R+let-7d mimics組let-7d表達(dá)顯著增高,NGF表達(dá)顯著降低。而OGD/R+let-7d inhibitor組作用與之相反。再次證實(shí)let-7d在OGD/R細(xì)胞模型中靶向調(diào)控NGF表達(dá)。研究證實(shí)NGF作為經(jīng)典內(nèi)源性保護(hù)因子,能顯著抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[19],因此本研究推測(cè)let-7d抑制劑調(diào)節(jié)OGD/R損傷機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控NGF信號(hào)通路發(fā)揮作用。

綜上所述,本研究探討并證實(shí)了體外let-7d抑制劑對(duì)海馬神經(jīng)元缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與上調(diào)NGF信號(hào)通路,抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。