余珊珊,孫 蕾,王 華,姜 玨,李 昊,周 琦*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科,西安 710004;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科;*通訊作者,E-mail:13909232905@163.com)

肝硬化是由多種因素長期反復(fù)作用導(dǎo)致肝組織發(fā)生壞死、炎癥乃至纖維化,殘存肝細(xì)胞結(jié)節(jié)性再生的彌漫性肝臟損傷的一類疾病。有研究[1,2]表明,肝硬化可損傷心臟的收縮、舒張功能,嚴(yán)重者可引起心衰,心肌重構(gòu)可能是肝硬化心臟功能出現(xiàn)衰退的原因,但是肝硬化患者心肌組織、細(xì)胞如何重構(gòu),這些病理改變?nèi)绾斡绊懶呐K功能尚不明確。本課題組前期的研究表明,應(yīng)用超聲心動(dòng)圖能夠檢測(cè)肝硬化患者左心室舒張功能的改變,并評(píng)估其收縮功能,在評(píng)價(jià)肝硬化患者心臟血流動(dòng)力學(xué)改變中具有重要意義[3-6]。由于心肌組織活檢創(chuàng)傷大,且肝硬化患者普遍存在凝血功能障礙[7],通常難以獲得肝硬化患者心肌組織病理學(xué)結(jié)果,故本研究采用肝硬化大鼠模型,并研究肝硬化大鼠心肌組織病理學(xué)改變及應(yīng)用高頻超聲評(píng)估其心臟功能,以期進(jìn)一步了解肝硬化對(duì)心肌帶來的改變及其與心功能改變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、模型建立及分組

雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,6-7周齡,體質(zhì)量(180±20)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(陜)2017-003。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為對(duì)照組(control,CON,n=10),肝硬化4周組(cirrhotic cardiomyopathy,CCM4,n=10)和肝硬化8周組(cirrhotic cardiomyopathy,CCM8,n=10)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及操作均通過西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(PlublicationNo.85-23,1985)。

對(duì)照組大鼠正常飲水及攝取普通顆粒飼料。將995 ml/L的CCl4分析純與大豆油配成400 ml/L、600 ml/L的CCl4油溶液，皮下注射部位選擇大鼠頸后皮下。肝硬化4周組第1-2周腹腔注射40% CCl4油溶液，2次/周(每周一、四)，首劑量0.5 ml/100 g，余0.3 ml/100 g，10%酒精溶液作為唯一飲用水；第3-4周皮下注射60% CCl4油溶液，2次/周(每周一、四)，劑量：0.3 ml/100 g，20%酒精溶液作為唯一飲用水。肝硬化8周組第1-2周腹腔注射40% CCl4油溶液，2次/周(每周一、四),首劑量0.5 ml/100 g，余0.3 ml/100 g。10%酒精溶液作為唯一飲用水；第3-8周皮下注射60% CCl4油溶液，2次/周(每周一、四)，劑量：0.3 ml/100 g，20%酒精溶液作為唯一飲用水。整個(gè)過程中觀察大鼠一般情況如毛色、活動(dòng)情況、有無死亡等，最后再次稱重。

1.2 大鼠高頻超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

肝硬化8周組及對(duì)照組大鼠均于造模第8周后進(jìn)行心功能超聲檢測(cè),各組大鼠心臟超聲檢查前均稱量體質(zhì)量,戊巴比妥(3 ml/kg)腹腔麻醉,仰臥位固定、胸部剃毛備皮。采用日立彩色超聲診斷儀進(jìn)行檢測(cè),EUP-L74線陣探頭,探頭頻率5-13 MHz。取胸骨旁左室長軸和短軸切面,由二維超聲引導(dǎo)M型曲線并進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量指標(biāo)包括:左室后壁厚度(left ventricular posterior wall,LVPW)、室間隔厚度(interventricular septal,IVS)、左室舒張末期前后徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室收縮末期前后徑(left ventricular end-systolic dia-meter,LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左房前后徑(left atrium diameter,LAD)、二尖瓣血流頻譜E峰及A峰的峰值流速比值(VE/VA)、E峰減速時(shí)間(DT)和心輸出量(cardiac output,CO)等。各指標(biāo)均在連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期上測(cè)量后取其平均值。

1.3 血清及組織標(biāo)本采集

肝硬化4周組于第4周后,肝硬化8周組及對(duì)照組大鼠均于第8周后心功能超聲檢測(cè)完畢后,處死大鼠,打開腹腔,腹主動(dòng)脈取血約5 ml,3 000 r/min離心15 min,收集血清,分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆?取血清約500 μl自然解凍后采用全自動(dòng)生化分析儀由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH),肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT);以及肝功能,包括血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清總膽紅素(TBIL)、血尿素氮(BUN)、血清肌酸酐(Cr)、凝血酶原時(shí)間活動(dòng)度(PTA)。打開大鼠胸腔,取大鼠肝臟和心臟,生理鹽水沖洗血液,清潔濾紙吸干表面水分,分別稱重肝臟和心臟濕重,先行大體肉眼觀察,然后取肝臟右葉相同部位肝組織和心尖相同部位心肌組織,4%多聚甲醛(用于HE染色)中浸泡固定制備石蠟切片。

1.4 心肌及肝臟組織HE染色

石蠟切片脫蠟后,蘇木素-伊紅染色,脫水,中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟及心肌組織病理改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

對(duì)照組大鼠毛色白而有光澤,觸之手感順滑,飲食、活動(dòng)皆正常;模型組大鼠毛色晦暗,粗糙,不順滑,毛發(fā)脫落,眼睛無神,活動(dòng)少。模型組大鼠厭酒精,飲用少,部分大鼠拒飲。對(duì)照組腹部皮下注射等量的生理鹽水,給予普通飼料和自來水。對(duì)照組無死亡,肝硬化4周組無死亡,肝硬化8周組死亡2只。與對(duì)照組體質(zhì)量線性增長相比,肝硬化8周組大鼠體質(zhì)量先下降后緩慢增加,但肝硬化8周組大鼠體質(zhì)量增加緩慢,后保持平穩(wěn)(見圖1)。

2.2 大鼠肝臟肉眼觀察結(jié)果

大體觀察:正常組肝臟顏色紅潤,表面光滑,質(zhì)地均勻柔軟;肝硬化4周組肝臟表面結(jié)節(jié)較小,體積較肝硬化模型組增大,質(zhì)地基本均勻,無黃色顆粒;肝硬化8周組肝臟外觀棕黃色,肝葉萎縮變形,體積減小,質(zhì)地變硬、質(zhì)量減輕,表面粗糙不光整,彌漫分布大小不均一的增生結(jié)節(jié),部分可見黃色顆粒分布,與正常肝臟形成鮮明對(duì)比。

圖1 肝硬化8周組和對(duì)照組大鼠體質(zhì)量變化情況Figure 1 Changes of body weight in cirrhosis 8 week group and control group

2.3 大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)

與對(duì)照組比較,肝硬化4周和8周組TBIL、BUN、Cr、ALB、PTA、ALT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肝硬化4周和8周組ALB、PTA較對(duì)照組減低(P<0.05)，而TBIL、ALT、BUN、Cr較對(duì)照組升高(P<0.05,見表1)。肝硬化8周組與4周組相比，TBIL、ALT、ALB、Cr、BUN、PTA差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

2.4 肝硬化組和對(duì)照組肝臟病理學(xué)

對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常,中央靜脈周圍肝細(xì)胞呈放射狀排列,無明顯炎性細(xì)胞浸潤。肝硬化4周組出現(xiàn)結(jié)締組織,肝小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。肝硬化8周組正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失或破壞而被假小葉所取代;部分假小葉由數(shù)個(gè)不完整的肝小葉構(gòu)成,中央靜脈偏向邊緣,甚至沒有中央靜脈;有的假小葉則由再生肝細(xì)胞結(jié)節(jié)構(gòu)成,肝細(xì)胞的排列和血竇的分布極不規(guī)則;假小葉內(nèi)肝細(xì)胞有不同程度的脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤,匯管區(qū)因結(jié)締組織增生而顯著增寬(見圖2),與正常肝臟形成鮮明的對(duì)比。

表1 對(duì)照組和肝硬化組大鼠血清學(xué)指標(biāo)變化Table 1 Changes of serological indicators in normal and cirrhotic rats

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與肝硬化4周組比較，#P<0.05

A.對(duì)照組 B.肝硬化4周組 C.肝硬化8周組圖2 對(duì)照組與肝硬化組大鼠肝臟組織HE染色 (×100)Figure 2 HE staining of rat liver in normal control group and cirrhosis groups (×100)

2.5 心肌病理學(xué)

對(duì)照組心肌纖維排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,居于細(xì)胞中央,心肌間質(zhì)及微血管等結(jié)構(gòu)正常;肝硬化4周組心肌纖維走向基本整齊,心肌出現(xiàn)空泡化以及間質(zhì)增生;肝硬化8周組可見心肌細(xì)胞腫脹、松散,排列紊亂,結(jié)構(gòu)不清晰,間質(zhì)內(nèi)血管擴(kuò)張充血,血管周圍見炎性細(xì)胞浸潤,細(xì)胞外間質(zhì)增多(見圖3)。

圖3 對(duì)照組與肝硬化組大鼠心肌組織HE染色Figure 3 HE staining of myocardium in normal control group and cirrhosis groups

2.6 對(duì)照組和肝硬化組常規(guī)超聲結(jié)果

與對(duì)照組比較,肝硬化8周組患者LVESD、LVEDD、IVS、LAD明顯增大,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);肝硬化8周組心輸出量增加、VE/VA比值降低、DT延長,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LVPWT和LVEF無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2、圖4)。

表2 對(duì)照組和肝硬化組常規(guī)超聲結(jié)果Table 2 Comparison of ultrasound results between control group and cirrhosis group

與對(duì)照組相比,*P<0.05

A.對(duì)照組 B.肝硬化8周組圖4 肝硬化大鼠超聲心功能檢測(cè)Figure 4 Echocardiographic results in cirrhotic rats

2.7 血清心肌酶及肌鈣蛋白的變化

與對(duì)照組相比,肝硬化4周和8周組大鼠心肌LDH、CK-MB、cTnT均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3)。肝硬化8周組與4周組相比，LDH、CK-MB、cTnT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3)。

表3 各組大鼠心肌酶及肌鈣蛋白比較Table 3 Comparison of myocardial enzymes and cTnT between three groups

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與肝硬化4周組比較，#P<0.05

3 討論

肝硬化在我國發(fā)病率高,是嚴(yán)重威脅我國居民健康的常見病、多發(fā)病,現(xiàn)有的治療效果并不理想,故建立適宜的肝硬化動(dòng)物模型對(duì)于評(píng)價(jià)療效具有不可忽視的作用。前期的臨床研究證實(shí),肝硬化患者可出現(xiàn)心臟收縮、舒張功能受損[3-6],心肌重構(gòu)可能是肝硬化心臟功能出現(xiàn)衰退的原因,但是其心肌組織和細(xì)胞如何重構(gòu),這些病理改變?nèi)绾斡绊懶呐K功能尚不明確。本研究采用大鼠進(jìn)行肝硬化造模,在成功造模的基礎(chǔ)上,對(duì)大鼠心肌病理、心臟功能、心肌酶及肌鈣蛋白等進(jìn)行了檢測(cè),有效地模擬了心肌損害,為臨床評(píng)價(jià)肝硬化心肌損害提供了有效的依據(jù)。

本研究使用四氯化碳+乙醇復(fù)合法對(duì)大鼠進(jìn)行肝硬化造模,實(shí)驗(yàn)組大鼠40%-60%四氯化碳皮下注射聯(lián)合20%乙醇作為大鼠唯一飲水源,4周時(shí)即可出現(xiàn)肝結(jié)締組織增生,8周左右正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失、破壞而被假小葉取代,部分假小葉由數(shù)個(gè)不完整的肝小葉構(gòu)成,中央靜脈偏向邊緣,甚至沒有中央靜脈,有的假小葉由再生肝細(xì)胞結(jié)節(jié)構(gòu)成,肝細(xì)胞排列和血竇分布均極不規(guī)則;假小葉內(nèi)的肝細(xì)胞有不同程度脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤,匯管區(qū)因結(jié)締組織增生顯著增寬,與正常肝臟組織形成鮮明對(duì)比,即可形成典型的肝硬化模型。與翟偉等[8]報(bào)道結(jié)果相一致,8周末肝細(xì)胞變性壞死、貯脂細(xì)胞開始活化。該方法可加速肝臟纖維化過程,縮短造模時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了對(duì)照組以及肝硬化4周和8周組血清生化學(xué)相關(guān)指標(biāo)的變化,結(jié)果顯示對(duì)照組、肝硬化4周和8周組TBIL、BUN、Cr、ALT、ALB、PTA等指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肝硬化4周和8周組ALB、PTA均較對(duì)照組減低(P<0.01)，而TBIL、ALT、BUN、Cr較對(duì)照組升高(P<0.01),肝硬化8周組與肝硬化4周組相比，TBIL、ALT、ALB、Cr、BUN、PTA差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這進(jìn)一步提示應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)的肝硬化模型造模成功。大鼠肝臟組織病理學(xué)結(jié)果及血清生化指標(biāo)均提示,隨著給藥時(shí)間的延長,肝硬化程度更加明顯,這與肝硬化的發(fā)生發(fā)展病理過程相一致。

本研究檢測(cè)了肝硬化模型組與對(duì)照組心肌病理學(xué)變化,其中對(duì)照組心肌纖維排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,居于細(xì)胞的中央,心肌間質(zhì)和微血管等結(jié)構(gòu)正常;肝硬化4周組心肌組織開始出現(xiàn)變化,呈中間過渡狀態(tài),心肌纖維走向基本整齊,心肌出現(xiàn)空泡化以及間質(zhì)增生;肝硬化8周組可見心肌細(xì)胞腫脹松散、排列紊亂、結(jié)構(gòu)不清晰、間質(zhì)內(nèi)血管擴(kuò)張充血、血管周圍炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外間質(zhì)增多。這表明肝硬化大鼠8周后出現(xiàn)了明確的心肌損害,肝硬化大鼠心肌細(xì)胞及間質(zhì)均存在明顯結(jié)構(gòu)改變:心肌細(xì)胞腫脹,間質(zhì)細(xì)胞增多。這說明肝硬化大鼠不僅發(fā)生了心肌細(xì)胞肥大,還可出現(xiàn)心肌間質(zhì)增生,即心肌間質(zhì)亦發(fā)生了重構(gòu)。這一改變可能是心臟收縮、舒張功能減低的病理學(xué)基礎(chǔ),心肌間質(zhì)重構(gòu)包括心臟成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)質(zhì)和量異常,以及微血管結(jié)構(gòu)的改變。分布于心臟細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原主要有Ⅰ、Ⅲ、ⅡⅤ和Ⅴ等型,其中Ⅰ型膠原占膠原總量的2/3以上[9],是心肌ECM的最主要組成成分,其硬度大,回彈伸展性小,抗?fàn)坷詮?qiáng),能夠保持心室壁的強(qiáng)度和硬度。少量Ⅰ型膠原的增加,即可增加心肌僵硬度,從而影響心臟的收縮和舒張功能。心肌間質(zhì)膠原的獨(dú)特結(jié)構(gòu)對(duì)心臟收縮及舒張功能有著重要的作用,而Ⅰ型膠原作為基質(zhì)主要構(gòu)成成分,其數(shù)量及適當(dāng)?shù)谋戎祵?duì)維持心肌組織結(jié)構(gòu)及心臟功能的完整性具有非常重要的意義[10]。本研究中大鼠心肌組織中細(xì)胞外間質(zhì)明顯增多,從病理學(xué)角度解釋了前期實(shí)驗(yàn)肝硬化患者心臟功能減低的可能機(jī)制,由于條件限制,本實(shí)驗(yàn)并沒有能夠?qū)Υ笫笮募〖?xì)胞外間質(zhì)成分進(jìn)行進(jìn)一步分型研究,期待今后的研究工作能夠?qū)υ錾男募￠g質(zhì)成分進(jìn)行分型,進(jìn)一步闡明心肌病理學(xué)改變與心功能減低的關(guān)系。

生物化學(xué)標(biāo)志物如心肌酶和心肌蛋白是反應(yīng)心肌損傷的指標(biāo)之一,前者有天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST),乳酸脫氫酶(LD)、肌酸激酶(CK)及其同工酶,后者有肌鈣蛋白。心肌在缺氧缺血、甚至壞死時(shí),心肌細(xì)胞膜通透性可能發(fā)生變化,存在于心肌內(nèi)的心肌標(biāo)記物易于釋放,從而引起心肌酶學(xué)相關(guān)標(biāo)志物的改變。本研究檢測(cè)了對(duì)照組與肝硬化4周和8周組心肌損傷相關(guān)標(biāo)志物,與對(duì)照組相比較,肝硬化4周和8周組大鼠心肌LDH、CK-MB以及肌鈣蛋白顯著升高(P<0.05);肝硬化8周組與4周組相比，LDH、CK-MB、cTnT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這提示應(yīng)用本研究方法,肝硬化造模8周后出現(xiàn)了明顯的心肌損害,這從心肌酶學(xué)角度提示了肝硬化心肌損害模型的成功。

本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了肝硬化8周組常規(guī)超聲相關(guān)指標(biāo)的變化。其中肝硬化8周組與對(duì)照組比較,LVESD、LVEDD、IVST、LAD明顯增大,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);肝硬化模型8周組心輸出量增加、VE/VA比值降低、DT延長,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);這與臨床肝硬化患者超聲診斷的結(jié)果相一致,提示該造模方法在一定程度上可以模擬肝硬化患者心肌損害從而導(dǎo)致心功能的變化。高頻超聲能夠清晰地檢測(cè)大鼠心臟功能的各項(xiàng)指標(biāo),肝硬化大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)較對(duì)照組有所減低,為研究肝硬化心肌病發(fā)病機(jī)制提供了一種有效的模型和檢驗(yàn)方法。

綜上所述,肝硬化是我國的常見病和多發(fā)病,也是一種死亡率較高的全球性疾病。許多研究證實(shí)[11,12],肝硬化早期時(shí)心臟功能呈代償性改變,即心輸出量、心率、血漿容量增加,動(dòng)脈壓下降,外周阻力下降,CCM作為肝硬化患者的重要并發(fā)癥之一,其臨床癥狀隱匿,未受到人們重視,對(duì)肝硬化患者心臟損害的早期診斷和治療已經(jīng)成為臨床治療肝硬化一個(gè)重要部分[13]。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了肝硬化大鼠心肌細(xì)胞損害及高頻超聲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)的出現(xiàn)心功能的減低,為進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。