楊正生,張路芳,代秀榮,林寧寧,宋鐵軍

(秦皇島市第一醫(yī)院皮膚科,秦皇島 066000;*通訊作者,E-mail:ylxd785@126.com)

銀屑病是一種慢性炎癥性疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前的研究結(jié)果表明,很多病理因素參與其中。銀屑病的發(fā)病是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,細(xì)胞的免疫應(yīng)答在其中起著至關(guān)重要的作用,而其中細(xì)胞因子對(duì)于免疫細(xì)胞的活化以及信號(hào)通路的激活起到了重要的橋梁作用。近來的研究表明[1],Th22(T輔助細(xì)胞22)細(xì)胞因子IL-22參與了炎癥性細(xì)胞的免疫過程,能夠活化某些重要的細(xì)胞信號(hào)通路,同時(shí)能夠維護(hù)表皮的完整性。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在角質(zhì)形成細(xì)胞增殖以及銀屑病的發(fā)病過程中起到非常重要的作用[2]。姜黃素作為一種天然提取的物質(zhì),能夠在急慢性炎癥性疾病中起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用。姜黃素能夠抑制很多皮膚炎癥反應(yīng)以及過氧化物、環(huán)氧化酶等炎癥因子的表達(dá)[3]。由于姜黃素具有良好的抗炎及免疫調(diào)節(jié)特性,目前在很多免疫性疾病的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究利用永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)作為研究對(duì)象,首先明確IL-22對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞STAT3磷酸化蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)而研究姜黃素對(duì)IL-22誘導(dǎo)的STAT3磷酸化的干預(yù)作用,從而明確姜黃素對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)下的某些細(xì)胞信號(hào)通路活化的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 永化生人角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT細(xì)胞,中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。

1.1.2 主要試劑及儀器 姜黃素(美國(guó)Sigma公司);RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司);重組人IL-22(美國(guó)Perotech公司);p-STAT3(Tyr705)兔抗人單克隆抗體(美國(guó)Cell Signal公司);STAT3兔抗人多克隆抗體、β-actin、羊抗兔二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞,培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基中(含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素),培養(yǎng)箱條件:含5%濃度的CO2,溫度37 ℃。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后傳代,一般選取給予2-4代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 在HaCaT細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),將細(xì)胞消化后吹打成單細(xì)胞懸液,然后按照1×105/ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)板,待到細(xì)胞完成70%-80%融合時(shí),更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn):首先在不同時(shí)間點(diǎn)(0,5,15,30,60 min)加入IL-22(20 ng/ml)后用Western blot法檢測(cè)磷酸化STAT3和總STAT3的蛋白表達(dá)情況(n=3)。此外,將細(xì)胞分為5組,即姜黃素4個(gè)不同濃度預(yù)處理組以及對(duì)照組。即在加入IL-22刺激細(xì)胞前1 h加入不同濃度的姜黃素(0,2.5,5,10 μmol/L),另設(shè)對(duì)照組只加培養(yǎng)基。

1.2.3 蛋白免疫印跡(Western blot法)檢測(cè)p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá) 處理和干預(yù)HaCaT細(xì)胞后,用預(yù)冷的PBS液體洗3遍,每孔加1 ml RIPA裂解液+5 μl PMSF(100 mmol/L)+5 μl磷酸化酶抑制劑(100 mmol/L),搖勻置于冰上。收集細(xì)胞,裂解液離心后檢測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取上清,10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳。放置好電極,安裝好轉(zhuǎn)印裝置,按300 mA穩(wěn)流，轉(zhuǎn)膜40 min,轉(zhuǎn)膜后的膜分別用兔抗人p-STAT3、STAT3(二者均為1 ∶2 000稀釋)4 ℃孵育過夜后洗滌,加用二抗(羊抗兔,1 ∶500稀釋)室溫孵育2 h,ECL暗室曝光顯色。麗春紅S染色5-10 min(肉眼可見轉(zhuǎn)膜是否成功),ddH2O漂洗數(shù)次,將染色完全清洗干凈。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組比較用單因素方差分析(ANOVA)和q檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-22對(duì)HaCaT細(xì)胞p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

在未接受刺激之前,HaCaT細(xì)胞幾乎沒有磷酸化STAT3(p-STAT3,Tyr705位點(diǎn))的表達(dá)。但經(jīng)IL-22體外培養(yǎng)的刺激后,HaCaT細(xì)胞中p-STAT3表達(dá)隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng),明顯增強(qiáng),根據(jù)Western blot的檢測(cè)結(jié)果,用IL-22(20 ng/ml)刺激HaCaT細(xì)胞30 min時(shí)達(dá)到最高峰,60 min時(shí)p-STAT3的表達(dá)略有下降的趨勢(shì)(見圖1)。

圖1 IL-22刺激不同時(shí)間后HaCaT細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of p-STAT3 in HaCaT cells after treatment with IL-22 for different time

2.2 姜黃素對(duì)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,姜黃素能夠明顯下調(diào)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)(P<0.01),而對(duì)總STAT3的表達(dá)則無明顯影響(見圖2),提示姜黃素劑量依賴性地下調(diào)HaCaT中p-STAT3/STAT3的比值,隨著濃度增加,這一數(shù)值逐漸降低。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與IL-22組比較,#P<0.05,##P<0.01圖2 姜黃素對(duì)IL-22誘導(dǎo)的p-STAT3蛋白表達(dá)影響Figure 2 Effect of different concentrations of curcumin on expression of p-STAT3 in HaCaT cells induced by IL-22

3 討論

銀屑病是一種慢性皮膚炎癥性疾病,其重要的病理學(xué)特點(diǎn)為角質(zhì)形成細(xì)胞的異常的增殖和分化,造成這一現(xiàn)象的原因非常復(fù)雜,目前認(rèn)為一些炎癥性細(xì)胞因子在其中發(fā)揮了重要的作用。

STAT家族最初是作為一種DNA結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn),被認(rèn)為參與了某些干擾素依賴的基因表達(dá)的調(diào)控。STATs在未被激活前通常存在于胞漿中,在受到一些胞外信號(hào)配體的刺激后被激活,其活化形式進(jìn)入核內(nèi),發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。某些分子包括細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)因子等均可以激活STAT信號(hào)通路[4]。STAT家族中的STAT3的活化與很多惡性增殖性疾病的發(fā)病存在著密切的聯(lián)系。STAT3發(fā)生磷酸化后形成二聚體,進(jìn)入細(xì)胞核,識(shí)別并結(jié)合到靶基因的DNA特異性反應(yīng)元件上,并且使其下游的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),上調(diào)某些基因的表達(dá)[5]。Sano等[2]通過免疫組化發(fā)現(xiàn)在銀屑病患者的皮損處和鄰近皮損處的正常組織中存在大量的處于磷酸化狀態(tài)的STAT3表達(dá),而正常人或其他某些非銀屑病的皮膚病患者皮損處STAT3僅見少量非磷酸化的表達(dá),以上提示STAT3信號(hào)通路的激活與銀屑病的產(chǎn)生、持續(xù)和發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)。

白細(xì)胞介素(interleukin)22是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的炎癥性因子,主要由活化的T輔助細(xì)胞中的Th22細(xì)胞、Th17細(xì)胞以及活化NK細(xì)胞分泌產(chǎn)生。IL-22屬于IL-10家族成員,目前被認(rèn)為在很多與自身免疫相關(guān)的炎癥反應(yīng)以及宿主的免疫防御中發(fā)揮著重要作用[6]。角質(zhì)形成細(xì)胞是IL-22重要的靶細(xì)胞之一,其能夠調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化,因此,IL-22參與了很多皮膚的炎癥和免疫性疾病的產(chǎn)生和發(fā)展,其中銀屑病患者的皮損和外周血中可以發(fā)現(xiàn)IL-22的表達(dá)較對(duì)照正常人明顯增高,而且血中的IL-22水平與銀屑病的嚴(yán)重程度密切相關(guān),而且皮損處的IL-22 mRNA也存在異常表達(dá)升高[7]。以上研究結(jié)果表明拮抗IL-22的生物學(xué)效應(yīng)可能是銀屑病潛在的治療靶點(diǎn)之一。

姜黃素是一種由姜黃屬草本的根莖提取的多酚類物質(zhì),目前認(rèn)為姜黃素對(duì)很多由于細(xì)胞惡性增殖引起的疾病具有很好的治療前景[8],同時(shí)具有很強(qiáng)的抗炎、抗氧化的功能。姜黃素發(fā)揮其生物學(xué)功效很大程度上是因?yàn)槠淠軌蛘{(diào)控某些轉(zhuǎn)錄因子的活化[9],其中有報(bào)道[10]姜黃素對(duì)一些惡性腫瘤細(xì)胞的STAT3的激活具有明顯的抑制作用,從而抑制了細(xì)胞的惡性增殖,促進(jìn)了其凋亡。但姜黃素能否抑制某些細(xì)胞因子引起的角質(zhì)形成細(xì)胞中STAT3的活化作用,目前尚未見明確的報(bào)道。本研究以HaCaT細(xì)胞作為研究對(duì)象,擬明確姜黃素是否對(duì)IL-22誘導(dǎo)下STAT3的磷酸化具有干預(yù)作用。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果,有以下發(fā)現(xiàn):①經(jīng)IL-22(20 ng/ml)體外培養(yǎng)的刺激后,HaCaT細(xì)胞中p-STAT3(Tyr705位點(diǎn))表達(dá)隨著時(shí)間延長(zhǎng),明顯增強(qiáng),并在30 min時(shí)達(dá)到最高峰。②加入IL-22前用姜黃素(2.5,5,10 μmol/L)預(yù)處理1 h,明顯下調(diào)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT的p-STAT3的表達(dá),而且這種抑制作用具有劑量依賴性的特點(diǎn)。以上為姜黃素治療銀屑病等角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖性疾病提供了理論依據(jù)。