錢琳琳，張萍淑，孟燕，張利平，喬思佳，元小冬

神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但研究表明氧化應(yīng)激、內(nèi)外環(huán)境因素、遺傳傾向、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）等均參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。較多的文獻(xiàn)表明阿爾茨海默病、帕金森病的發(fā)病機(jī)制與錯(cuò)誤、未折疊蛋白的聚集有關(guān)[1,2]。同時(shí)有相關(guān)證據(jù)指明ERS在脊髓損傷、缺血性腦損傷、Huntington舞蹈?。℉untington disease，HD）、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellar ataxias，SCA）等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前，ERS抑制劑苯丁酸甘油酯（Ravicti）已被應(yīng)用于治療尿酸循環(huán)障礙，并取得較好療效，但對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用尚在動(dòng)物模型階段，而4-PBA用于治療創(chuàng)傷性腦損傷大鼠后其神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)能力較為顯著，認(rèn)為ERS干預(yù)劑在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用前景比較樂觀，因此為研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病與ERS的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 ERS

生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的跨膜蛋白抑制物阻性酯酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、Ⅰ型跨膜蛋白蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、活 性 轉(zhuǎn) 錄 因 子 6（activating transcription factor-6，ATF6）分別與分子伴侶蛋白GRP78/Bip相結(jié)合，處于失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等刺激后，三種跨膜蛋白與分子伴侶蛋白分離，引發(fā)ERS。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑引發(fā)的細(xì)胞凋亡主要包括三條通路[3,4]：①CHOP/GADD153基因激活通路：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤蛋白或未折疊蛋白無法得到糾正時(shí)，ATF6持續(xù)表達(dá)，激活下游細(xì)胞凋亡基因CHOP/GADD153表達(dá)，CHOP可抑制分子伴侶蛋白GRP78/BIP和抗細(xì)胞凋亡基因BCL-2的表達(dá)，耗竭谷胱甘肽，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性的氧自由基（reactive oxygen species，ROS），使細(xì)胞發(fā)生凋亡。②JNK通路：長(zhǎng)時(shí)間激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1這一核心感受器通路，會(huì)激活TRAF-ASK1-JNK途徑，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。③Caspase-12通路：Caspase-12是ERS特有的相關(guān)蛋白酶，活化的Caspase-12發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。

2 體外ERS誘導(dǎo)

2.1 衣霉素與ERS

核糖體合成無活性的蛋白受N端信號(hào)肽的控制進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行修飾，轉(zhuǎn)換具有生物活性的蛋白質(zhì)，其修飾主要包括二硫鍵形成、化學(xué)修飾（甲基化、乙?；⑻腔?，大多數(shù)分泌型蛋白均需要蛋白質(zhì)糖基化修飾。蛋白質(zhì)糖基化主要有N-糖苷鍵、O-糖苷鍵，N-連接的寡糖都在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行的。蛋白質(zhì)的糖基化具有重要的生理作用：①蛋白質(zhì)的糖基化修飾是其正確折疊、建立穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)的重要環(huán)節(jié)。②糖基化修飾后的蛋白具有抵抗蛋白酶消化、持久的生物活性。③參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

衣霉素誘導(dǎo)ERS是通過抑制蛋白質(zhì)糖基化修飾[5]，在研究中表明1 mg/L的衣霉素可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬作用，但當(dāng)隨著衣霉素濃度的升高及時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]。有明確證據(jù)指出在分子水平上，脊髓損傷后ERS相關(guān)蛋白CHOP、Caspase-12、elf-2α表達(dá)量顯著升高，同時(shí)與脊髓損傷修復(fù)相關(guān)69號(hào)蛋白（spinal cord injury repair related protein 69，SCIRR69）也可能也與ERS有關(guān)，其機(jī)制可能是激活bZIP類轉(zhuǎn)錄因子后增加SCIRR69的表達(dá)[7]，所以認(rèn)為在脊髓損傷的早期輕度給予衣霉素有助于脊髓損傷修復(fù)。

2.2 毒胡蘿卜素與ERS

鈣離子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子ATP酶從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)攝入，又通過肌醇-1,4,5-三磷酸受體/鈣離子（InaP3）通道釋放，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白基質(zhì)相互作用分子1（stromal interaction molecule l，STIM1）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)中的Ca2+感受器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的穩(wěn)態(tài)通過這三個(gè)基本結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)[8]。鈣蛋白酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與Caspase-12結(jié)合形成鈣離子感受器，失衡的Ca2+激活鈣蛋白酶，活化的鈣蛋白酶進(jìn)一步激活半胱氨酸家族，剪切相關(guān)凋亡蛋白，如BCL-2、P53，并直接剪切活化細(xì)胞凋亡執(zhí)行者Caspase-3、7等，導(dǎo)致其凋亡。

毒胡蘿卜素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的ATP依賴性鈣泵，發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡。使用毒胡蘿卜素處理多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞以激活ERS，觀察到腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮、崩裂，而且其凋亡率增加，凋亡因子CHOP、Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)[9]。因此，推測(cè)毒胡蘿卜素可用來治療相似的腫瘤疾病。

2.3 蛋白酶體抑制劑與ERS

Naidoo[10]報(bào)道細(xì)胞在進(jìn)行蛋白翻譯修飾過程中大約有1/3的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)將通過泛素蛋白酶體（ubiquitin-proteasome system，UPS）途徑進(jìn)行降解。錯(cuò)誤、未折疊蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)向高爾基體后被泛素標(biāo)記，被標(biāo)記的蛋白質(zhì)被蛋白酶體識(shí)別后降解[11,12]。

因此UPS抑制劑被廣泛應(yīng)用于各種ERS模型的建立。李曉歐等[13]使用不同濃度蛋白酶體抑制劑Eeyarestatin對(duì)大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的遞增，大鼠肝細(xì)胞ERS標(biāo)志蛋白CHOP、Caspase-12、Caspase-3、GRP78明顯升高并且細(xì)胞活性逐漸降低，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加自噬標(biāo)志性蛋白LC3和Beclin 1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，所以蛋白酶體抑制劑能引發(fā)蛋白的另一降解途徑即自噬，自噬的發(fā)生可能與ERS通路中的IRE1、PERK、Ca2+引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。白東[14]在體外對(duì)人星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤使用UPS抑制劑（MG-132）后，發(fā)現(xiàn)隨著MG-132濃度的升高，細(xì)胞凋亡率明顯升高。當(dāng)藥物濃度大于10 μmol/L時(shí)，可顯著抑制其增殖分化的能力。

目前蛋白酶體抑制劑多應(yīng)用于各種腫瘤細(xì)胞治療，細(xì)胞凋亡為腫瘤細(xì)胞的治療提供新的思路。Ceruti等[15]對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞株使用蛋白酶抑制劑后可顯著增加Caspase-3的表達(dá)量，細(xì)胞凋亡率明顯增加。雖然蛋白酶體抑制為腫瘤細(xì)胞治療方面提供新的視野，但蛋白酶體抑制劑與其他腫瘤治藥物缺點(diǎn)相同，缺乏特異性，而且蛋白酶抑制劑在體內(nèi)對(duì)正常細(xì)胞、組織的影響也尚未可知，這也是蛋白酶體抑制劑的缺陷。

2.4 棕櫚酸與ERS

ERS早期，IRE1通過剪切轉(zhuǎn)錄因子X盒結(jié)合蛋白1（X box binding protein 1，XBP1）的mRNA中的一個(gè)內(nèi)含子，快速清除在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蓄積的未折疊蛋白，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡。但ERS持續(xù)存在時(shí)，活化的IRE1招募腫瘤壞死因子2受體相關(guān)因子（TNF-receptor-associated factor2，TRAF2），IRE1與TRAF2一起激活JNK，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[16]。XBP1可體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪酸合成基因的轉(zhuǎn)錄，特異性敲除肝臟細(xì)胞中的XBP1基因后，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的膽固醇及其甘油三酯合成明顯下降，小鼠脂肪肝的發(fā)生率明顯下降[17]。Ozcan等[18]發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠的肝臟中活化的IRE1 α表達(dá)量與正常小鼠相比顯著升高，IRE1下游因子磷酸化的JNK也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。

棕櫚酸引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的細(xì)胞凋亡機(jī)制主要是影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)，切斷蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)通路[19]，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣泵被破壞導(dǎo)致Ca2+濃度降低，影響蛋白質(zhì)的折疊，引發(fā)ERS。

3 體外ERS抑制及其機(jī)制

3.1 salubrinal及其ERS

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激時(shí)，PERK與分子伴侶分離，游離的PERK使蛋白翻譯起始因子elF-2α磷酸化，阻止蛋白質(zhì)合成，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的壓力。另一方面磷酸化的elF-2α增加下游基因活化轉(zhuǎn)錄因子-4（activating transcription factor-4，ATF-4）的表達(dá)，ATF-4又活化CHOP（C/EBP homology protein）及 GADD34（growth arrest and DNA damage inducible 34）的表達(dá)，同時(shí)GADD34可使elF-2α脫磷酸化，合成蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物，加速處在ERS狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡。目前CHOP是如何導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制尚不完全清楚，但有資料顯示CHOP可增加Bid、Bim等促凋亡蛋白表達(dá)，并抑制抗凋亡蛋白的表達(dá)[20]。

Salubrinal主要通過抑制elF-2α磷酸化，阻止蛋白質(zhì)的翻譯及抗凋亡蛋白的生成，進(jìn)而發(fā)生ERS[21]。Rubovitch等[22]在對(duì)TAC小鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行salubrinal處理發(fā)現(xiàn)，ERS標(biāo)志蛋白GRP78、GRP94蛋白表達(dá)量下降，有效緩解小鼠的心臟肥大。目前，Salubrinal已被視為神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)中的神經(jīng)保護(hù)劑，降低ERS并且作為緩解神經(jīng)損傷的治療。同時(shí)，salubrinal治療降低脊髓損傷中過強(qiáng)的PERK-eIF2al-pha表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。在創(chuàng)傷性腦損傷中，通過salubrinal治療減輕ERS可防止受損小鼠皮質(zhì)中的神經(jīng)元死亡[23]。

3.2 4-苯基丁酸（4-phenyl butyric acid，4-PBA）及其ERS

細(xì)胞凋亡過程中PERK、ATF6、IRE1三個(gè)ERS途徑均可誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)[24,25]：①PERK通路中，磷酸化的elF-2α可激活A(yù)TF4及其下游因子的表達(dá)，形成PERK-elF2α-ATF4復(fù)合物，促進(jìn)凋亡因子CHOP的表達(dá)。②ATF6屬于二型跨膜蛋白，ERS時(shí)激活的ATF6進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并與核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物進(jìn)一步激活CHOP。③IRE1屬于Ⅰ型跨膜蛋白，IRE1活化后，其細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)招募TRAF2，形成IRE1-TRAF2-JNK后，激活下游信號(hào)分子CHOP。此外，有研究指出，PERK、CHOP、IRE1三個(gè)通路既可獨(dú)立激活CHOP，也可相互影響激活CHOP，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。

4-PBA抑制ERS主要通過以下機(jī)制：①抑制CHOP的表達(dá)。對(duì)小鼠心肌細(xì)胞采用10 mmol/L的4-BPA處理后，CHOP、Caspase-3表達(dá)量降低，心肌細(xì)胞的凋亡率也明顯下降[27]，同時(shí)其他文獻(xiàn)中同時(shí)發(fā)現(xiàn)低于10 mmol/L 4-PBA不能削弱CHOP的表達(dá)，但可通過其他通路，如增加Caspase-3表達(dá)量來引發(fā)細(xì)胞凋亡[28]。②促進(jìn)泛素蛋白酶途徑，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中由未折疊蛋白含量增加帶來的壓力。

4-PBA可作為神經(jīng)損傷治療的新型藥物，創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型中，Rancan等[29]根據(jù)感覺、運(yùn)動(dòng)功能的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)動(dòng)物創(chuàng)傷后神經(jīng)損傷程度，發(fā)現(xiàn)使用4-PBA治療的大鼠與未治療組相比，其神經(jīng)功能評(píng)分在損傷后72 h內(nèi)均有所升高，同時(shí)處死后大鼠大腦皮質(zhì)處CHOP在損傷后72 h內(nèi)4-PBA處理組的表達(dá)量顯著降低，這表明4-PBA對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠具有治療作用。Yildirim等[30]發(fā)現(xiàn)4-PBA可以抑制組蛋白的去乙?；黾有∈竽X缺血區(qū)部位的組蛋白乙?；M蛋白乙?；稍黾颖Ｗo(hù)性蛋白表達(dá)如HSP70、Bcl2和下調(diào)損傷性蛋白的表達(dá)如P53、BAX等而抗神經(jīng)元缺血性損傷。雖然有較多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)4-PBA對(duì)動(dòng)物模型的治療具有顯著意義，但采用的濃度卻大相徑庭，這可能是由于采用的動(dòng)物、組織不同造成的。

3.3 硫辛酸與ERS

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大約33%的蛋白質(zhì)在進(jìn)行修飾、折疊過程中依賴于氧化還原酶類和細(xì)胞內(nèi)相對(duì)較高的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而細(xì)胞內(nèi)大約25%的ROS參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊[31]。ROS通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡主要包括兩個(gè)通路：①攻擊維持蛋白折疊酶活性所必需的巰基，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)被氧化修飾，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊酶或分子伴侶功能異常。②影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+平衡，氧化應(yīng)激反應(yīng)及ROS濃度的改變影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+通道，在亞硝酸鹽誘導(dǎo)ERS引發(fā)的急性早幼粒白血病NB4細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，給予ROS抑制劑后可抑制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+升高，同時(shí)細(xì)胞凋亡率也顯著下降，說明ROS引發(fā)細(xì)胞凋亡與Ca2+失衡有關(guān)[32]。

4 ERS干預(yù)價(jià)值及治療展望

ERS干預(yù)應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療策略：①適量ERS激動(dòng)劑：適量的ERS可使分子伴侶GRP78/Bid表達(dá)量增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+輕度升高，幫助未折疊蛋白增加，提高神經(jīng)細(xì)胞對(duì)ERS抵抗力，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死的可能性。如此，ERS預(yù)處理法有望應(yīng)用于腦梗死、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中。②抑制ERS引發(fā)的細(xì)胞凋亡：CHOP是PERK、ATF6信號(hào)通路的下游分子，CHOP的表達(dá)增加可抑制抗凋亡蛋白BCl-2的表達(dá)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的細(xì)胞凋亡。因此使用CHOP抑制劑可能會(huì)減輕由ERS引發(fā)的神經(jīng)退行性病變類疾病。elF-2α是真核細(xì)胞蛋白翻譯起始因子之一，故抑制其磷酸化可以抑制蛋白質(zhì)的翻譯，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，這可能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療拓展另一途徑。

美國(guó)食品藥品管理局（FDA）已在2013年2月正式批準(zhǔn)將ERS抑制劑Ravicti治療尿素循環(huán)障礙。44例已使用Buphenyl（屬于治療尿素循環(huán)障礙的藥物）的成年患者被隨機(jī)分配服用Buphenyl或 Ravicti 2周，然后再轉(zhuǎn)換服用2周Buphenyl或Ravicti中的另一藥物，結(jié)果顯示在控制血液中氨水平方面，Ravicti與Buphenyl一樣有效。另外三項(xiàng)在兒童和成年人身上進(jìn)行的臨床研究證實(shí)，Ravicti對(duì)≥2歲的患者具有長(zhǎng)期的安全性和有效性[36]。而雖然ERS干預(yù)劑尚未應(yīng)用于人體，但療效或許比較客觀。

ERS干預(yù)劑目前被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物模型中，ERS與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展有緊密聯(lián)系，但ERS干預(yù)劑治療人神經(jīng)系統(tǒng)疾病卻存在很多問題需要攻破：①目前很多的ERS阻斷劑只是應(yīng)用于某一條通路，或阻斷某一重要因子防止發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡，沒有從源頭上解決問題，當(dāng)應(yīng)激持續(xù)存在時(shí)，阻斷因子的上游將發(fā)生大量的蛋白堆積，這對(duì)細(xì)胞來講也是一種應(yīng)激因素。②目前ERS干預(yù)劑只應(yīng)用于各種細(xì)胞、動(dòng)物模型中，體內(nèi)應(yīng)用干預(yù)劑治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病目前較少，并且療效也并不完全明確。③干預(yù)劑具有濃度及時(shí)間依賴的特點(diǎn)：對(duì)于誘導(dǎo)劑及阻斷劑需要掌握適量的濃度，對(duì)不同類型的干預(yù)劑、細(xì)胞，不同狀態(tài)下的細(xì)胞所需要的濃度不同，高濃度或低濃度將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生相反的作用。如達(dá)到相同效果的ERS下衣霉素對(duì)肝細(xì)胞的與心肌細(xì)胞所需的濃度也不盡相同。筆者也認(rèn)為同一干預(yù)劑對(duì)不同年齡段的細(xì)胞處理濃度也不相同，因此需要進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究及動(dòng)物模型對(duì)ERS干預(yù)劑的濃度進(jìn)行調(diào)試，希望為今后的臨床工作開展提供基石。

盡管大量研究已證明某些特殊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白通過ERS與某些神經(jīng)疾病有相關(guān)性，但ERS與神經(jīng)疾病之間相互作用迄今仍沒有明確的答案。因此，研究ERS機(jī)制與神經(jīng)疾病之間的關(guān)系，對(duì)ERS進(jìn)行干預(yù)可為神經(jīng)系統(tǒng)病變提供新的治療思路。