張園，展佳愔，孟柯，孫勇，邢影

基因治療（gene therapy）是指將外源正?；蛐蛄袑氚屑毎?，取代患者體內的缺陷DNA序列，糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，從而達到治療目的。在基因治療的過程中，最關鍵的步驟是構建基因載體，通過基因載體將外源目的DNA序列遞送到靶細胞，從而進行有效的轉染與表達[1]。迄今所應用的轉導目的基因的方法可分為兩大類：病毒載體和非病毒載體。病毒載體作為高效的基因遞送系統(tǒng)，具有轉染及表達效率高等優(yōu)點，是體內高效表達外源基因最有效的工具之一。但由于其具有免疫原性高、容量小、制備困難、損傷靶器官、生產成本高等缺陷，限制了其在基因治療中的應用。與病毒載體相比，非病毒載體以其制備簡單、低毒性、低免疫原性、可生物降解等優(yōu)點，成為近年來基因轉運中的常用載體[2]。陽離子脂質體作為非病毒載體中研究最多的一種載體，在基因治療中有著廣闊的前景，本文就陽離子脂質體在基因治療方面的作用進行綜述。

1 脂質體及陽離子脂質體結構特點

脂質體（liposomes）由具有類似生物膜的磷脂結構及其他類脂組成，在水中，這種結構分散形成多層微囊，每個微囊就是脂質體。按所包含脂質雙分子層的層數(shù)不同，分為單室脂質體和多室脂質體，小單室脂質體（small unicompartment liposomes）粒 徑 約 0.02～0.08 μ m；大 單 室 脂 質 體（large unicompartment liposomes）為單層大囊泡，粒徑為0.1～1 μm，多層雙分子層的泡囊稱為多室脂質體（multi-chamber liposomes），粒徑為1～5 μm。按結構分：單室脂質體、多室脂質體、多囊脂質體；按電荷分：中性脂質體、負電荷脂質體、正電荷脂質體；按性能分：一般脂質體、特殊功效脂質體、熱敏脂質體、pH敏感脂質體、光敏脂質體和磁性脂質體等[3]。陽離子脂質體（cationic liposome）由一個正電荷的兩性化合物（即陽離子脂質）及一個中性脂質形成。陽離子脂質也稱為細胞轉染素，作為陽離子脂質體進行細胞轉染的核心部位，其基本結構是一個帶正電的基團連接在一個疏水基上，因其攜帶的正電荷可與目的基因上的負電荷相互作用而結合，從而形成穩(wěn)定的復合物，增加在機體內的循環(huán)時間[4]。最常見的陽離子基團是銨、咪唑、賴氨酸和胺/多胺[5-8]；疏水基團則主要有：脂肪酰鏈和膽固醇環(huán)；常用的輔助脂質則有：二油磷酰乙醇胺（Two oil phosphoryl ethanolamine，DOPE）、磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine）、十八烷氨（Octadecane ammonia）等[9]。1987年Felgner等首先報道荷正電脂質體，證明陽離子脂質體可與質粒相結合，促進體外細胞基因序列的高效轉染，這一發(fā)現(xiàn)對于類脂/脂質體介導的基因傳遞研究具有決定性的意義[10]。

2 陽離子脂質體介導的基因轉移機制

作為一種基因載體，簡單描述陽離子脂質體介導的基因轉移過程為：攜帶正電荷的陽離子脂質體與攜帶負電荷的目的基因（DNA或RNA）序列通過靜電作用相互吸引結合，形成DNA/陽離子脂質體復合物，并可通過細胞內吞作用或膜融合作用進入細胞內，脂質復合物在細胞質中或進一步進入核內釋放基因，完成細胞內轉錄和翻譯。

2.1 DNA/陽離子脂質體復合物的形成及構像變化

通常陽離子脂質體由帶正電荷的脂類和中性輔助脂類以1∶1等摩爾混合。當陽離子脂質體（包含陽離子脂質體和中性的輔助脂質）與自身帶負電荷的基因靠近時，聚集的陽離子脂質可提供一種“雙面粘膠帶”，自發(fā)形成DNA/陽離子脂質體復合物（Lipoplexes），將陰離子DNA膠粘到陰離子細胞表面。也有研究表明，陽離子脂質體與帶負電荷的DNA結合后，DNA結構上的不平衡使得DNA出現(xiàn)結構上的“塌陷”，裸露的表面積減少，從而能被脂質體緊緊包裹。因此，陽離子脂質體與DNA的相互作用，包括完全包裹及表面結合兩種方式[11,12]。研究人員對復合物的結構進行廣泛深入的研究，通過同步加速器x射線衍射，發(fā)現(xiàn)幾個不同的納米級結構：在陽離子膜之間夾有DNA的普遍的層狀相；倒向的六角形相，DNA封裝在逆脂質管中（HjjC）和最近發(fā)現(xiàn)的HjC相，即六種排列的類似的小膠束被DNA鏈包圍著形成一個具有蜂巢對稱性的連續(xù)子結構，其中倒向六角形相結構的復合體大大促進DNA的釋放，并且具有較高的轉染率[13]。研究表明，不僅陽離子脂質體的內部成分比例會影響Lipoplexes的結構，陽離子脂質體和DNA的摩爾比也會影響Lipoplexes的形狀和大小。當正負電荷比例接近于1時，DNA/陽離子脂質體復合物結構會向倒向六角形結構變化，利于目的基因的釋放，提高轉染效率[14]。

2.2 跨膜

目前認為，DNA/陽離子脂質體復合物進入細胞的途徑有2種模式：通過細胞內吞作用進入；直接與細胞質膜融合。例如真核細胞中存在多種內吞途徑，較為普遍的是網(wǎng)格蛋白依賴性途徑、小窩蛋白介導的內吞途徑及巨噬細胞的吞噬作用等。丁會芹等[15]研究表明當轉運平均直徑小于500 nm的粒子時，內吞作用是復合體進入細胞的主要方式。通過電子和熒光顯微鏡觀察轉染細胞，可觀察到脂質體復合物附著于細胞表面，同時細胞膜下方的小囊泡及細胞內也可觀察到脂質體復合物的存在，證明復合物跨過細胞膜的主要途徑為內吞作用。Rejman等[16]研究發(fā)現(xiàn)真核細胞中網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導的胞吞作用具有顯著的顆粒尺寸依賴性。粒徑小于200 nm的顆粒通過網(wǎng)格蛋白依賴途徑進入細胞，隨著顆粒大小的增加，逐漸轉變?yōu)樾「C蛋白介導途徑，當顆粒大于500 nm時則通過能量依賴過程由細胞內化。另外，膜的融合過程也參與脂質體介導的基因轉染。常用的兩種膜蛋白為N-乙基順丁烯二酰亞胺-敏感融合蛋白（N-ethylmaleimide-sensitivefusionprotein，NSF）及可溶性NSF連接蛋白（Soluble NSF ligand）。相比較于膜融合作用而言，內吞途徑需要消耗能量，而當細胞處于4℃時，處于“休眠”狀態(tài)的細胞主要利用膜融合作用進行跨膜轉運[13,16]。

2.3 分離

脂質復合物進入細胞后，必須以有效的方式釋放目的基因序列，才能使正確的基因序列有效表達，發(fā)揮作用。脂質體復合物進入細胞后形成早期內涵體，隨后轉變?yōu)橥砥趦群w，在降解酶、溶酶體作用下形成內涵體-溶酶體系統(tǒng)，同時該過程伴隨復合物pH的降低。酸化的系統(tǒng)引起氯離子內流，使溶酶體漲裂，復合物從內涵體-溶酶體系統(tǒng)中逃逸。有研究表明，DOPE可能有幫助核酸釋放的作用，能明顯提高轉染效率，原因是在低pH值的情況下，陽離子脂質體向倒向六邊形結構的轉變。倒向六邊形結構有利于形成穩(wěn)定的脂質體結構，脂質體與溶酶體膜融合形成臨時空洞釋放DNA，且表面帶有陰離子基團的溶酶體與陽離子脂質體相互吸引，削弱了陽離子脂質體與DNA的結合，促使DNA高效釋放[16]。

2.4 攝取

DNA的大小是它們能否進入細胞核的重要因素，較大的DNA可能難以進入細胞核，除非它能與細胞核的主動轉運系統(tǒng)發(fā)生相互作用，例如對神經元細胞的成功轉染提示DNA可通過主動運輸穿過核膜[17]。對處于有絲分裂期的細胞而言，由于核膜已經破裂，主要機制是依賴于細胞分裂時的有絲分裂被動進入細胞核[18]。除此之外，核孔的直徑、細胞周期等因素也會影響細胞核對DNA的攝取。

3 陽離子脂質體在基因治療中的優(yōu)勢

與傳統(tǒng)的手術、放療、化療等藥物治療方法相比，基因治療作為一種具有突破性意義的靶向性生物基因治療方法，優(yōu)點在于針對性強、基本無副作用，對正常細胞無損傷，治療過程中痛苦小，因此在免疫缺陷病、代謝性疾病、癌癥、心臟病等疾病領域顯示出良好前景?；蜉d體是基因治療的關鍵技術之一，可保護基因不被內源性核酸酶降解，從而使基因治療的體內應用成為可能[19]。目前基因治療所使用的基因載體主要是病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體包括腺病毒、逆轉錄病毒及慢病毒，非病毒載體樣式多種多樣，主要有陽離子長鏈肽、陽離子聚合物和陽離子脂質體等。病毒載體作為一種分子生物學工具，可在活體或細胞培養(yǎng)中將自身或外源的基因組侵染到其他宿主細胞中。病毒載體的轉染效率很高，腺病毒的整合中具有9個癌相關基因或鄰近區(qū)域，但同時病毒載體也存在誘導免疫反應、致癌等臨床問題。例如，進入活體內的腺病毒載體的基因表達在1～7d達到高峰，并且在2～4周內迅速降到無法監(jiān)測的水平，同時在體內可監(jiān)測到針對病毒蛋白的細胞免疫和體液免疫，導致基因表達時間過短[20]；逆轉錄病毒的主要優(yōu)勢在于它們可以整合到宿主基因中，但同時有插入到癌前基因或腫瘤抑制基因的位點的可能，隨后誘導腫瘤發(fā)生[21]。陽離子脂質體作為非病毒載體的一種，與病毒載體相比具有以下優(yōu)勢：①保護治療基因在體內循環(huán)中不被降解。1987年，F(xiàn)elgner等[10]發(fā)現(xiàn)第一個陽離子脂質氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基銨（Trimethyl-2,3-dioleyl ammonium chloride），通過對脂質體的表面基團進行特殊修飾后的陽離子脂質體能很好地包封DNA片段，促進復合物與細胞膜的融合，增加DNA的攝取和表達；②特異性靶向性地遞送基因到靶組織或細胞。陽離子脂質體主要用于腫瘤方面，相比于病毒載體誘導腫瘤的發(fā)生來說，免疫增強、致癌基因沉默和自殺基因表達是陽離子脂質體用于腫瘤治療的獨特優(yōu)勢，其次為先天性單基因缺陷病和心血管疾病。在治療轉移性胰腺癌實驗中，經過靶向優(yōu)化后合成的紫衫醇陽離子脂質體Endo-Tag-1已進入Ⅱ期臨床實驗[22]；張俊峰等[23]研究發(fā)現(xiàn)在利用生長因子和抗凋亡基因治療缺血性卒中時，將缺氧反應元件通過基因載體轉染入細胞后，可從轉錄、轉錄后及翻譯后等不同分子水平特異性表達外源基因，避免治療基因非特異性表達導致腫瘤事件發(fā)生，也為缺血性腦卒中的治療提供新策略。③高效穿過細胞膜和核膜，轉染細胞，使其表達/沉默基因[24]。研究人員在考察陽離子脂質體對神經元SH-SYY細胞的轉染率和毒性時發(fā)現(xiàn)，雙十六烷基-N-精氨酸-L-谷氨酸（Dodecyl-N-arginine-L-glutamic acid）（含有氨基酸的脂質材料）具有更高的轉染率且毒性更低，并且在胎牛血清（Fetal bovine serum）存在時仍具有良好的血清相容性，因此可以大量使用以提高外源基因的表達。另外，在眼、口腔、鼻腔和經皮給藥途徑中，陽離子脂質體也有了成功嘗試。

4 展望

陽離子脂質體作為一種新型的藥物載體，具有靶向、長效、低毒、保護藥物等優(yōu)點，它的出現(xiàn)給諸多研究領域帶來了新曙光。隨著靶向脂質體等新型脂質的研發(fā)成功，將藥物或遺傳物質直接遞送至患病組織或機體，使得治療更具有特異性、高效性。但是如何更高效地傳遞遺傳物質或藥物仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。為了解決上述問題，近年來新開發(fā)的陰-陽離子脂質體在陽離子脂質體表面中和了一部分正電荷，減弱了陽離子脂質體的細胞毒性，一定程度上增加了復合物在體內的循環(huán)時間，但陰離子脂質體本身也存在一定的細胞毒性，這一問題無法避免。因此，通過添加各種輔助性成分、研制并使用新型脂質材料、對陽離子脂質體表面進行結構修飾、發(fā)明并使用新制備工藝等措施來提高陽離子脂質體的穩(wěn)定性、靶向性和轉染效率以及從分子生物學角度闡明陽離子脂質體介導的基因轉染過程的詳細機制將會是未來的重點研究方向。