錢銀芬 羅紅陽 錢偉 付茂蓉 曹磊 羅瑞 楊永曜

（1．貴州省烏當(dāng)區(qū)人民醫(yī)院，貴州 貴陽550018；2．貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽550002）

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人們生活水平的不斷改善。但是由于長期以來不合理的飲食習(xí)慣，例如長期大量攝入富含脂肪的肉類（豬肉）以及激素等食物［1］，導(dǎo)致我國由于高血脂引發(fā)的動脈粥樣硬化，冠心病以及高血壓等疾病發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。目前上述疾病已經(jīng)成為危害中老年人健康的主要疾病，并且其發(fā)病人群逐漸向青壯年群體遷移。對于上述疾病目前主要通過服用他汀類，煙酸類藥物進(jìn)行治療，雖然上述藥物具有較好的療效，但在部分患者引發(fā)失眠，抑郁等副作用，對長期服用的中老年人帶來嚴(yán)重的二次傷害［2］。近年來相關(guān)研究指出，多酚類化合物對于心腦血管具有重要的保護(hù)作用，漿果類食物由于其本身富含多酚類化合物，因此逐漸引起研究人員興趣［3］。研究發(fā)現(xiàn)，紅樹莓（rubus idaeus）提取物中含有大量的多酚類抗氧化物，并且臨床研究發(fā)現(xiàn)，長期服用紅樹莓漿果可以顯著改善高血脂以及心腦血管疾病患者病情［4］，但是，目前對于紅樹莓漿果改善高血脂以及心腦血管疾病的機(jī)制尚不清楚，基于此，本研究以ApoE－／－基因敲除小鼠作為研究對象，探究紅樹莓提取物在改善血脂以及動脈粥樣硬化中的作用機(jī)制，以期初步闡明紅樹莓提取物對血脂以及動脈粥樣硬化作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供一定的理論以及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)中，選取本局飼養(yǎng)的66只16周齡的ApoE－／小鼠作為研究對象，體重為280±20g。飼養(yǎng)條件為室溫21±2℃，相對濕度為60%～65%。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：紅樹莓提取物由本實(shí)驗(yàn)室制備；血清TG、TAG、NO、SOD、iNOS、GSH、SOD、GPx酶活測定試劑盒，血液抗凝劑購買于Thermo Fisher（US）；低溫離心機(jī)，酶標(biāo)儀購買于Eppendorf（Germony）；NF－κB抗體、TNF－α抗體、VCAM－1抗體購于abcam 上海貿(mào)易有限公司，其余試劑購買于上海生物工程有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）實(shí)驗(yàn)動物分組：在本研究當(dāng)中，將ApoE－／－小鼠隨機(jī)分為A－F六組，每組11只，其中A 組為對照組（給予相應(yīng)蒸餾水）、B 組為模型組（給予相應(yīng)蒸餾水）、C 組為紅樹莓低濃度（red raspberry－L，2.5g／kg·d）、D 組為紅樹莓中濃度組（red raspberry－M，5g／kg·d）、E 組為紅樹莓高濃度組（red raspberry－H，10g／kg·d）、F組為阿托伐他汀鈣片組（atorvastatin calcium，0．35mg／kg·d）。（2）模型建立及取材：實(shí)驗(yàn)前，對照組每日給予普通飼料喂養(yǎng)3周，模型組、紅樹莓各濃度組、阿托伐他汀鈣片組在HFD（脂肪21%，蛋白質(zhì)20%，膽固醇0．15%）條件下飼養(yǎng)3周。3周后，對照組及模型組給予等量蒸餾水喂養(yǎng)，紅樹莓各濃度組給予不同濃度的紅樹莓提取物喂養(yǎng)，分別為2.5g／kg·d，5g／kg·d，10g／kg·d，阿托伐他汀鈣片組給予0．35mg／kg／d的等量阿托伐他汀鈣片，期間均給予普通飼料喂養(yǎng)12周。12周后，各組小鼠禁食但不禁水24h。常規(guī)麻醉后打開腹腔分離主動脈組織用于染色觀察，同時抽取主動脈血液樣本5mL，4 ℃1 000 rpm 離心10min后分離血漿與血清，并將其保存于－20 ℃條件下備用［5］。（3）各項(xiàng)生化指標(biāo)及酶活測定：檢測血清中TC、TAG、NO 水平及SOD、iNOS、GSH、SOD、GPx酶活，具體操作均按照相關(guān)試劑盒進(jìn)行；HE 染色以及免疫組化檢測參照試劑盒說明書進(jìn)行。（4）Western－blotting檢測：參照Tian H．文獻(xiàn)［6－8］檢測主動脈組織中NF－κB、TNF－α及VCAM－1的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對于本研究中所獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，通過SPAA 20．0 軟件進(jìn)行分析，相關(guān)統(tǒng)計(jì)資料通用（±s）表示，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對照組和模型組小鼠主動脈病理學(xué)檢測 HE 染色結(jié)果顯示，對照組小鼠主動脈內(nèi)膜完整平滑，主動脈壁薄厚均勻，無明顯增生，未觀察到AS斑塊的形成（圖1A）。與對照組相比，模型組小鼠主動脈壁明顯增生，厚度不均勻，主動脈內(nèi)膜不完整，出現(xiàn)AS病灶（圖1B）。

圖1 對照組和模型組小鼠主動脈組織HE染色（×100）

2.2 紅樹莓對ApoE－／－小鼠主動脈斑塊的影響 與對照組相比，未經(jīng)紅樹莓提取物處理的模型組小鼠中主動脈管壁粥樣硬化區(qū)域所占比例（27．4±3.8）%與主動脈脂質(zhì)體區(qū)域比例（4.1±1.3）%明顯升高；與模型組相比，紅樹莓各濃度組及阿托伐他汀鈣片組主動脈管壁粥樣硬化區(qū)域比例，以及主動脈脂質(zhì)體區(qū)域比例明顯降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。通過紅樹莓各濃度組間的比較發(fā)現(xiàn)，隨著紅樹莓濃度的升高，小鼠主動脈管壁粥樣硬化區(qū)域所占比例與主動脈脂質(zhì)體區(qū)域比例呈現(xiàn)下降的趨勢，說明紅樹莓可減少主動脈管壁粥樣硬化及脂質(zhì)體區(qū)域的比例，抑制斑塊的形成。見表1。為觀察紅樹莓對ApoE－／－小鼠主動脈斑塊的影響，本實(shí)驗(yàn)對主動脈組織進(jìn)行免疫組化檢測。結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過高濃度紅樹莓處理的小鼠（圖2B）及經(jīng)過阿托伐他汀鈣片處理的小鼠（圖2C）主動脈中，病變細(xì)胞數(shù)顯著少于模型組中未經(jīng)過紅樹莓處理的小鼠（圖2A），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。這表明，紅樹莓可以在一定程度上抑制主動脈內(nèi)脂肪堆積，

表1 不同處理組動脈粥樣硬化區(qū)域以及脂質(zhì)體區(qū)域的比較

圖2 ApoE－／－小鼠主動脈免疫組化檢測結(jié)果

2.3 紅樹莓對ApoE－／－小鼠血脂水平的影響 由表2可知，模型組小鼠血清TC為22.84±2.95mmol／L，TAG 為（9．48±1.33）mmol／L。與模型組相比，紅樹莓各濃度組及阿托伐他汀鈣片組的小鼠血清中TC與TAG 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。紅樹莓各濃度組與阿托伐他汀鈣片組相比較，血清TC 和TAG 的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。通過紅樹莓各濃度組間的比較發(fā)現(xiàn)，紅樹莓濃度越高，小鼠血清TC 和TAG 的水平越低。結(jié)果說明紅樹莓可以顯著降低ApoE－／－小鼠血清TC以及TAG 的含量，且其抑制效果與阿托伐他汀鈣片相似。

表2 紅樹莓不同濃度組對ApoE－／－小鼠血脂水平的比較

2.4 紅樹莓對ApoE－／－小鼠NO、iNOS、GSH，SOD以及GPx活性的影響 與對照組相比，模型組小鼠血液中NO、iNOS、GSH，SOD 以及GPx活性顯著下降。與模型組相比較，紅樹莓低、中、高濃度組和阿托伐他汀鈣片濃度組中NO、iNOS、GSH，SOD 以及GPx 活性顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。相關(guān)研究表明，NO 在細(xì)胞內(nèi)可以參與氧化脅迫相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)程［9］，且圖2顯示經(jīng)紅樹莓各濃度處理后的ApoE－／－小鼠體內(nèi)過氧化物清除相關(guān)酶的活性升高，說明了紅樹莓可能通過提高血液中相關(guān)酶活進(jìn)而參與相關(guān)氧化脅迫反應(yīng)。

圖3 紅樹莓對ApoE－／－小鼠NO、iNOS、GSH、SOD 以及GPx活性的影響

圖4 各組小鼠主動脈NF－κB、TNF－α及VCAM－1蛋白的表達(dá)

2.5 紅 樹 莓 對ApoE－／－小 鼠NF－κB 、TNF－α 及VCAM－1蛋白水平的影響 通過Western－blotting方法，測定不同紅樹莓濃度組小鼠內(nèi)NF－κB、TNFα及VCAM－1蛋白的表達(dá)水平。與模型組相比，紅樹莓各濃度組與阿托伐他汀鈣片組的小鼠體內(nèi)NFκB、TNF－α及VCAM－1的蛋白水平均表現(xiàn)為下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。此外，紅樹莓各濃度組間對比發(fā)現(xiàn)，隨著紅樹莓濃度的升高，小鼠體內(nèi)NF－κB、TNF－α及VCAM－1的蛋白水平呈下降趨勢，說明NF－κB、TNF－α及VCAM－1的蛋白水平與紅樹莓的濃度表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。見圖3。

3 討 論

動脈粥樣硬化（AS）是一種慢性炎性疾病，與心肌梗塞等心腦血管疾病的許多危險因素有關(guān)［10］。目前，動脈粥樣硬化由于高發(fā)病率，降低壽命等原因，已成為全球范圍內(nèi)公共衛(wèi)生問題［11］。AS病理變化以血管內(nèi)壁脂質(zhì)斑形成為特征，導(dǎo)致管腔狹窄、硬化，進(jìn)而影響組織血供。本研究利用ApoE－／－小鼠建立AS模型，使用不同濃度的紅樹莓持續(xù)干預(yù)12周，結(jié)果顯示，與模型組相比，紅樹莓各濃度組主動脈管壁粥樣硬化區(qū)域比例與主動脈脂質(zhì)體區(qū)域比例明顯減少，血脂水平有所下降，提高了NO、iNOS、GSH 等過氧化物清除相關(guān)酶的活性，且抑制NF－κB、TNF－α及VCAM－1 的蛋白水平。說明紅樹莓可通過提高血液中相關(guān)酶活來參與相關(guān)氧化脅迫反應(yīng)，進(jìn)而改善動脈粥樣硬化。

紅樹莓也稱木莓，通過對其提取物中相關(guān)成分的研究發(fā)現(xiàn)，紅樹莓提取物中含有豐富的抗癌物質(zhì)例如鞣化酸等［12］，目前研究發(fā)現(xiàn)，該類物質(zhì)對于多種腫瘤以及癌癥具有顯著的療效。相關(guān)臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鞣化酸在人體內(nèi)較易被吸收進(jìn)入血液系統(tǒng)，從而在體內(nèi)發(fā)揮一定的作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，鞣化酸在體內(nèi)可以顯著抑制癌細(xì)胞等對周圍組織細(xì)胞的損害，單手其具體機(jī)制目前尚不清楚［14－17］。紅樹莓除了富含抗癌物質(zhì)鞣化酸外，還含有大量的多酚類抗氧化物。有研究發(fā)現(xiàn)，長期服用紅樹莓漿果可以顯著改善高血脂以及心腦血管疾病患者病情［4］。在本研究當(dāng)中，我們首次利用ApoE－／－小鼠研究紅樹莓是否對小鼠體內(nèi)血脂及動脈粥樣硬化具有顯著療效。結(jié)果表面其可以顯著降低主動脈粥樣硬化區(qū)域所占比例，同時亦可以顯著降低主動脈細(xì)胞中脂肪顆粒含量，進(jìn)而降低主動脈粥樣硬化的惡化進(jìn)程，且與阿托伐他汀鈣片處理組相比，其效果并無顯著差異。并且本研究首次通過測定經(jīng)過紅樹莓提取物處理的ApoE－／－小鼠體內(nèi)NO 等含量證明，紅樹莓提取物處理的小鼠其體內(nèi)NO 等相關(guān)信號分子等的含量顯著升高，同時相關(guān)研究結(jié)果表明，NO 在體內(nèi)可以參與一系列氧化脅迫進(jìn)程，例如其可以通過激活相關(guān)抗氧化系統(tǒng)來降低細(xì)胞內(nèi)過氧化物的含量進(jìn)而對細(xì)胞祈禱保護(hù)作用。

本次研究首次發(fā)現(xiàn)，紅樹莓可增加NO 含量導(dǎo)致下游相關(guān)的超氧陰離子清除酶例如GSH，SOD以及GPx火星顯著升高，從而降低細(xì)胞內(nèi)過氧化物以及其它超氧陰離子含量進(jìn)而對主動脈細(xì)胞起到一定保護(hù)作用，此外還通過干擾NF－κB／VCAM－1通路，抑制平滑肌細(xì)胞的遷移、減輕炎癥和減少主動脈管壁粥樣硬化區(qū)域與主動脈脂質(zhì)體區(qū)域，進(jìn)而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。本研究對紅樹莓漿果改善高血脂以及心腦血管疾病的機(jī)制提供了理論依據(jù)，為動脈粥樣硬化的治療提供了新思路。