李丹 陳麗茹 劉玉潔

（衡水市第三人民醫(yī)院檢驗科，河北 衡水053000）

近年來，纖維支氣管鏡的應(yīng)用可得到質(zhì)量較高的標(biāo)本，應(yīng)用痰涂片抗酸染色和培養(yǎng)的檢測方法雖然陽性率有所提高，但仍不能滿足臨床工作的需要。如何提高胸腔積液診斷的效率，一直是臨床研究的重點問題。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，新型的分子檢測方法利福平耐藥實時熒光定量核酸擴(kuò)增（Xpert MTB／RIF）技術(shù)逐步受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注，且痰液Xpert MTB／RIF 試驗已被證實診斷肺結(jié)核具有較高的診斷效能［1－2］，但在肺泡灌洗液中的試驗數(shù)據(jù)尚顯不足。我院自引入國內(nèi)Xpert MTB／RIF檢測系統(tǒng)以來，始終密切關(guān)注氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF檢測對菌陰肺結(jié)核的診斷作用，現(xiàn)擬創(chuàng)新性研究，以80例疑似肺結(jié)核患者為對象，評價支氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF檢測對菌陰肺結(jié)核的診斷價值。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取衡水市第三人民醫(yī)院2017年2月至2018年4月期間收治的疑診肺結(jié)核患者80例為研究對象，其中男54例，女26例，年齡18～60歲，平均（43.29±8．77）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）具有疑似肺結(jié)核的臨床表現(xiàn)（發(fā)熱、咳嗽、咯血、胸悶等）；（2）纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗前3次痰涂片抗酸染色陰性或無痰；（3）胸部影像學(xué)改變（肺部陰影、感染或結(jié)節(jié)）考慮活動性肺結(jié)核可能；（4）有纖支氣管鏡術(shù)及灌洗術(shù)適應(yīng)癥，取得氣管肺泡灌洗液，接受Xpert MTB／RIF 檢測；（5）臨床各項資料完善；（6）患者或家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并肺外結(jié)核、復(fù)治肺結(jié)核；合并嚴(yán)重的其他感染性疾?。唬?）伴發(fā)認(rèn)知功能、交流障礙；（3）既往曾接受抗結(jié)核治療；（4）具有精神病、癲癇病史；（5）依從性差。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過。

1.2 檢測方法 （1）支氣管鏡檢查：所有患者均進(jìn)行纖維支氣管鏡（奧林巴斯BF－P30）檢查，仔細(xì)觀察各肺段支氣管黏膜病變情況，結(jié)合胸部CT 明確病變累及肺段的支氣管，并進(jìn)行刷檢、涂片，然后實施灌洗，相應(yīng)支氣管肺段以纖支鏡灌入10～20mL 生理鹽水，并用纖維支氣管鏡負(fù)壓吸引回收灌洗液至無菌瓶內(nèi)，根據(jù)患者的實際情況可重復(fù)灌洗2～3次，最終確保收集灌洗液約10mL，送醫(yī)院實驗室后平均分裝于①、②、③三管中，加入等量消化液，混合均勻。以3 000轉(zhuǎn)／min離心（離心半徑15cm）20 min后備檢。（2）涂片法、培養(yǎng)法：刷檢及肺泡灌洗液①涂片采用萋尼染色鏡檢（染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司）找抗酸桿菌（涂片）；肺泡灌洗液②培養(yǎng)采用改良羅氏培養(yǎng)基分枝桿菌培養(yǎng)（培養(yǎng)）；并行菌種鑒定及藥物敏感試驗（drug sensitivity test，DST），詳細(xì)步驟參照中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會制定的實驗室檢查規(guī)程［3］。（3）Xpert MTB／RIF檢測：將1 mL 肺泡灌洗液③中加入1 mL樣本處理液充分混勻，放置15min并間斷搖晃至樣本完全液化，并以無菌吸管將2mL 液體移入試劑盒中，后者插入Gene Xpert檢測平臺中，輸入樣本相關(guān)信息后運行，Gene Xpert儀器自動完成樣本的過濾、洗滌，超聲溶菌釋放出DNA 后與PCR反應(yīng)試劑混合，以半巢式實時擴(kuò)增并檢測熒光信號，儀器可于2h后自動給出檢測結(jié)果。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)及分組 肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》［4］，以肺泡灌洗液羅氏培養(yǎng)結(jié)果及臨床診斷為最終診斷結(jié)果，可分為確診病例、臨床診斷病例2類，其中確診病例為肺泡灌洗液分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性；對于不具備細(xì)菌學(xué)及病理學(xué)診斷證據(jù)，但胸部影像學(xué)顯示與活動性肺結(jié)核相符，具有明顯的臨床癥狀或PPD 強(qiáng)陽性或肺外組織病理證實為結(jié)核病，且能夠排除其他肺部疾病的患者可歸為臨床診斷病例。本研究80例患者根據(jù)上述檢查結(jié)果進(jìn)行分組，確診病例、臨床診斷病例為肺結(jié)核病組，否則為非肺結(jié)核病組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 選用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19．0分析和處理研究數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采取率（%）表示，以肺泡灌洗液羅氏培養(yǎng)診斷標(biāo)準(zhǔn)、臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為肺結(jié)核陽性標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計Xpert MTB／RIF 檢測診斷肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確性，不同檢測方法對肺結(jié)核的診斷效能對比進(jìn)行χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；兩種檢驗方法的一致性采用Kappa檢驗，以K≥0．4表示一致性好。

2 結(jié) 果

2.1 診斷結(jié)果 本研究入選的80例疑診肺結(jié)核患者中，確診病例36例、臨床診斷病例22例，即肺結(jié)核病組患者58例；余22例為非肺結(jié)核病組，包括慢性阻塞性肺疾病7例、普通肺炎6例、支氣管擴(kuò)張4例、肺癌4例及播散性非結(jié)核分枝桿菌肺病1例。

2.2 Xpert MTB／RIF檢測診斷菌陰肺結(jié)核的結(jié)果 肺結(jié)核病組中，36 例確診病例中Xpert MTB／RIF檢測均為陽性，22 例臨床診斷病例中18 例Xpert MTB／RIF檢測為陽性；非肺結(jié)核病組中有2例Xpert MTB／RIF檢測為陽性，包括1例肺癌及1例播散性非結(jié)核分枝桿菌肺病。以肺泡灌洗液羅氏培養(yǎng)診斷標(biāo)準(zhǔn)、臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為肺結(jié)核陽性標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB／RIF 檢測診斷菌陰肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確性分別為93.10%、90．91%、96．43%、83.33%、92.50%，均高于80%，其診斷效能明顯優(yōu)于培養(yǎng)法、涂片法。見表1—4。

表1 培養(yǎng)法與菌陰肺結(jié)核診斷結(jié)果對比（n）

表2 涂片法與菌陰肺結(jié)核診斷結(jié)果對比（n）

表3 Xpert MTB／RIF檢測與菌陰肺結(jié)核診斷結(jié)果對比（n）

2.3 Xpert MTB／RIF檢測利福平耐藥的結(jié)果 36例肺泡灌洗液羅氏培養(yǎng)陽性的患者中8例對利福平耐藥，其中2例Xpert MTB／RIF 檢測為敏感，1例耐藥情況不確定。以DST 結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB／RIF檢測利福平耐藥的敏感度、特異度為62.50%、89．29%，Xpert MTB／RIF 檢測利福平耐藥與DST 結(jié)果一致率為83.33%，Kappa檢驗一致性好（K＝0．59，95%CI＝0．55～0．87）。見表5。

表5 分枝桿菌陽性病例Xpert MTB／RIF檢測利福平耐藥與DST 結(jié)果對比（n）

3 討 論

長期以來，肺結(jié)核與耐藥肺結(jié)核的早期診斷始終是結(jié)核領(lǐng)域的有待克服的難題之一，其診斷主要依靠痰涂片抗酸桿菌染色（抗酸桿菌），雖然其是結(jié)核病診斷最常用、快速的診斷方法，但其敏感度低，臨床報道在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性標(biāo)本中靈敏度僅為45%～48%甚至更低［5］，且肺結(jié)核患者中，痰液稀少及無痰者占比超過30%，即使誘導(dǎo)排痰有助于增加排痰量，提高痰抗酸桿菌檢出率，但是仍有不少患者無法排除足夠及高質(zhì)量的痰液［6］。即使可取得痰標(biāo)本，當(dāng)前的實驗室診斷技術(shù)抗酸染色要求標(biāo)本的菌濃度高，結(jié)核抗體假陰、假陽性率高，羅氏培養(yǎng)法因所需時間長而難以及時進(jìn)行診斷。隨著支氣管鏡檢查的廣泛開展，直接觀察氣管支氣管受累部位及嚴(yán)重程度成為可能，并可完成刷檢涂片、肺泡灌洗及活檢病理等檢查，特別值得關(guān)注的是，對于痰液稀少或無法自主排痰的患者而言，氣管肺泡灌洗液已成為必不可少的檢查標(biāo)本［7－8］。

Xpert MTB／RIF 技術(shù)是集樣品準(zhǔn)備、標(biāo)本處理、DNA 提取、定量PCR 擴(kuò)增和熒光擴(kuò)增檢測于一身的核酸擴(kuò)增檢測分析系統(tǒng)，目前主要用于結(jié)核分枝桿菌特異核酸以及利福平耐藥基因rpoB 突變檢測，在獨立的反應(yīng)孔中加入待檢測樣品后2h內(nèi)即可快速獲取檢測標(biāo)本中是否含有結(jié)核菌及是否對利福平耐藥。此項技術(shù)于21世紀(jì)以后才得以推廣使用，2014年WHO 發(fā)布新的Xpert MTB／RIF 使用指南［9］，明確推薦將其應(yīng)用于肺結(jié)核、兒童結(jié)核及肺外結(jié)核的診斷及利福平耐藥監(jiān)測。本研究80例疑診肺結(jié)核患者中，培養(yǎng)確診病例36例、臨床診斷病例22例，即以肺泡灌洗液羅氏培養(yǎng)診斷標(biāo)準(zhǔn)、臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為肺結(jié)核陽性標(biāo)準(zhǔn)，明確診斷肺結(jié)核病組58例，其中36例確診病例中Xpert MTB／RIF檢測均為 陽 性（100%），22 例 臨 床 診 斷 病 例 中18 例（81.82%）Xpert MTB／RIF 檢測為陽性，提示菌陰肺結(jié)核患者中Xpert MTB／RIF 陽性檢查率高。Xpert MTB／RIF檢測診斷菌陰肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確性分別為93.10%、90．91%、96．43%、83.33%、92.50%，均高于80%，其診斷效能明顯優(yōu)于培養(yǎng)法、涂片法。高春景等［10］的報道顯示，以臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為診斷肺結(jié)核的陽性標(biāo)準(zhǔn)，氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF檢測對診斷菌陰肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值均高于80%。韓丹等［11］的報道亦顯示，Xpert MTB／RIF檢測結(jié)核分枝桿菌診斷肺結(jié)核的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確度均優(yōu)于纖支鏡灌洗液抗酸涂片、結(jié)核培養(yǎng)。與本研究結(jié)果相符，均表明氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF檢測診斷菌陰肺結(jié)核的臨床價值高。

此外，大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株對異煙肼和利福平耐藥，故結(jié)核分枝桿菌耐藥情況可一定程度上作為疑似耐多藥結(jié)核病的監(jiān)測指標(biāo)［12］，而Xpert MTB／RIF檢測可同時實現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥的檢測。為此本研究進(jìn)一步將Xpert MTB／RIF檢測的耐藥結(jié)果與DST 加過對比，發(fā)現(xiàn)以DST 結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB／RIF 檢測利福平耐藥的敏感度、特異度為62.50%、89．29%，二者的一致率為83.33%，Kappa檢驗一致性好。陳子芳等［13］對肺泡灌洗液培養(yǎng)陽性的32例患者進(jìn)行利福平耐藥性檢測，檢測結(jié)果顯示利福平耐藥率率12.5%，與Gene Xpert MTB／RIF 檢測結(jié)果一致。孫蕊 等［14］的 最 新 報 道 亦 證 實Gene Xpert MTB／RIF與傳統(tǒng)藥敏檢測（固體培養(yǎng)法、傳統(tǒng)比例法）利福平耐藥的結(jié)果一致性好（K 值均＞0．5）。

綜上，氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF 檢測對診斷菌陰肺結(jié)核及快速判斷是否利福平耐藥有突出的應(yīng)用價值。