郭偉鑫 趙琦 王秀琳 梁江 黃曜勇 楊梅 劉立莉

（1．貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽550025；2．貴州中醫(yī)藥大學(xué)笫二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽550001）

大腸息肉是所有向腸腔突出的贅生物總稱。大腸息肉可分為腺瘤息肉與非腺瘤息肉，而研究表明結(jié)直腸腺瘤發(fā)展與結(jié)腸癌密切相關(guān)。多數(shù)研究認(rèn)為息肉的發(fā)生與腸隱窩中的腸道干細(xì)抱的異?？寺『驮鲋撤只嘘P(guān)［1］。結(jié)直腸腺瘤患者往往有大便變形、大便稀溏、大便習(xí)慣改變的臨床表現(xiàn)。以寒濕氣候、飲食偏辛辣的云貴地區(qū)，趙琦教授認(rèn)為腺瘤的發(fā)生發(fā)展與中醫(yī)濕聚痰凝，聚而成塊機(jī)理相似，臨床使用三仁湯主藥（苦杏仁、薏苡仁、半夏）治療結(jié)腸息肉患者能改善其臨床癥狀。但目前缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)其作用機(jī)制，本研究擬從該方核心藥物及相關(guān)干預(yù)基因、CRA 患者與正常人黏膜組織差異基因取交集，通過生物信息分析，理論上探索該方治療CRT 潛在基因靶點(diǎn)，為后續(xù)靶點(diǎn)實(shí)驗(yàn)提供理論研究。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究資料 CRA 患者與正常人黏膜組織差異基因數(shù)據(jù)集的獲取在公共基因GEO 數(shù)據(jù)庫（即GeneExpression Omnibus，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／geo／）數(shù)據(jù)庫中下載CRA 患者與常人黏膜組織對比研究4塊芯片數(shù)據(jù)（見表1）。將獲取的數(shù)據(jù)導(dǎo)入GCBI自帶實(shí)驗(yàn)室分析軟件，按照其生物信息分析模塊構(gòu)建路線圖（見圖1）進(jìn)行自動(dòng)運(yùn)算分析，獲得4 套芯片中CRA 患者與常人差異基因后取交集①（其中差異分析Q＜0．05，差異倍數(shù)1.2，若各條芯片中差異基因＜10，則取并集）。

圖1 生物信息分析路線圖

1.2 三仁湯中主藥潛在靶基因數(shù)據(jù)集的獲取 以苦杏仁、薏苡仁、半夏為主題詞在BATMAN—TcM（a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，http：／／bionet．ncpsb．org／batman－tcm／）、 TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http：／／lsp．nwu．edu．cn）檢索3味藥物化學(xué)成分及對應(yīng)調(diào)節(jié)基因，各自刪除重復(fù)項(xiàng)后取交集?？嘈尤?、薏苡仁、半夏分別有113.38．116個(gè)化學(xué)成分，對應(yīng)的靶點(diǎn)基因分別為296、131、386個(gè)。取交集后得出化學(xué)成分2個(gè)（亞麻酸、油酸），得出靶基因數(shù)據(jù)集②共有115個(gè)。

1.3 分析方法 將數(shù)據(jù)集①②取交集后得到3個(gè)靶點(diǎn)基因分別為MYC、HNF4A、GCG，將這3 個(gè)靶基 因 代 入STRING （functional protein associa－tion networks，https：／／string－db．org，http：／／bionet．ncpsb．org）對其功能、生物過程進(jìn)行GO 分析（Gene Ontology，表2），信號(hào)通路富集KEGG 分析（表3），以及參與生物功能的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析（MCODE分析），以上分析取前15條，不足15條者展示所有條目。

2 結(jié) 果

2.1 CRA 患者與正常人黏膜組織差異基因數(shù)據(jù)集 在GEO 數(shù)據(jù)集檢測見表1。

表1 CRA 患者與正常人黏膜組織差異基因研究芯片

對原始芯片數(shù)據(jù)，首先進(jìn)行芯片信號(hào)值的預(yù)處理與預(yù)過濾，然后使用差異分析方法SAM 法，05次對所納入的1．套芯片數(shù)據(jù)進(jìn)G 差異基因的篩選。差異基因的篩選條件為P＜0．05，差異倍數(shù)≥1.5倍，其中從GSE37364中獲得差異基因8 956個(gè)，有3 744個(gè)表達(dá)上調(diào)，5 212個(gè)表達(dá)下調(diào)；從GSE77953中獲得差異基因5 833個(gè)，2 878個(gè)表達(dá)上調(diào)，2 955個(gè)表達(dá)下調(diào)；從GSE81804 中獲得差異基因1 044個(gè)，有321 個(gè) 表 達(dá) 上 調(diào)，723 個(gè) 表 達(dá) 下 調(diào)；從GSE50592中獲得差異基因5 574個(gè)，3 120個(gè)表達(dá)上調(diào)，2 454個(gè)表達(dá)下調(diào)；4塊基因芯片差異基因取交集后得到246個(gè)，進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

2.2 ①②數(shù)據(jù)集交集基因生信分析結(jié)果

表2 生物過程GO 分析結(jié)果

表3 KEGG 通路分析結(jié)果

2.3 MCODE分析結(jié)果 ①②數(shù)據(jù)集交集后得到MYC、HNF4A、GCG 3個(gè)基因，經(jīng)擴(kuò)張相關(guān)基因范圍后，MCODE 分析結(jié)果如下圖（圖2，圓圈表示基因，連線表示關(guān)聯(lián)性，連線越多表示作用越緊密，箭頭所指為下游基因，相反則為上游基因），通過后期文獻(xiàn)回顧，我們發(fā)現(xiàn)MYC、HNF4A、GCG 參與各種癌癥、腫瘤過程，其中MYC、HNF4A 關(guān)系密切，這3個(gè)基因同時(shí)為TP53上游基因，TP53為明星基因，參與多種癌癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這3個(gè)通過同時(shí)參與調(diào)節(jié)TP53，以TP53為樞紐參與結(jié)直腸癌通路形成過程。見圖2。

圖2 MCODE分析網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

CRA 當(dāng)屬于中醫(yī)學(xué)“腸瘤”、“泄瀉”、“積聚”等范疇，王慶其等［2］認(rèn)為結(jié)腸腺瘤由痰、瘀、濕、毒積聚久而成積形成。在濕寒氣候的貴州西南地區(qū)CRA患者以大便稀溏、大便習(xí)慣及形狀改變等作為主要臨床癥狀，且CRA 為結(jié)腸癌前期階段。趙琦教授以“疾病一病因一病機(jī)一方藥”為思想，認(rèn)為結(jié)直腸腺瘤主要病機(jī)為痰濕凝聚成塊，病位在腸，發(fā)病與脾相關(guān)；用三仁湯中杏仁、半夏、薏苡仁為核心藥物，根據(jù)臨床兼證及舌脈象加減相關(guān)中藥治療該證。三仁湯特點(diǎn)為宣中焦、降肺氣。其中半夏性溫，歸脾胃肺經(jīng)，有燥濕化痰，消痞散結(jié)，降逆止嘔之效，更有學(xué)者［3］通過實(shí)驗(yàn)證明半夏成分中凝集素可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖生長，那么半夏其他成分能否抑制結(jié)直腸黏膜異常增生值得探索；薏苡仁性甘淡微寒，歸脾胃肺大腸經(jīng)，有清熱利濕，除風(fēng)濕，利水消腫，益肺健脾之效，有學(xué)者［4－5］分別通過實(shí)驗(yàn)的方法證實(shí)薏苡仁脂可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，薏苡仁油可治療結(jié)直腸癌術(shù)后患者，提高免疫力及降低相關(guān)腫瘤標(biāo)志物；杏仁性溫，歸肺大腸經(jīng)，有降肺氣、祛痰潤腸之效，有學(xué)者［6］實(shí)驗(yàn)證明苦杏仁中所含蛋白同樣可以抑制結(jié)腸在細(xì)胞增分裂且具有濃度依賴性。趙琦教授以三仁湯針對本病從濕論治，以健脾化濕，降氣化痰為治則往往奏效，雖此方藥臨床效果不錯(cuò)，但針對CRA 組織作用效果與靶點(diǎn)仍未探明。課題組已在前期研究中用生信分析的方法驗(yàn)證了中藥對骨關(guān)節(jié)炎的靶基因預(yù)測［7］，本研究擬用相同方法進(jìn)行三仁湯主藥對CRA 的靶點(diǎn)預(yù)測。

CRA 目前公認(rèn)是結(jié)腸癌的發(fā)展前期，提出“腺瘤一癌序列”學(xué)說，Shussmant N 等［8］認(rèn)為腺瘤一癌序列的形成是基因改變的累積結(jié)果。多數(shù)研究認(rèn)為腺瘤與腸道干細(xì)胞的過分增殖克隆分化相關(guān)，細(xì)胞增殖分裂速度超過細(xì)胞的凋亡速度從而使腸干細(xì)胞在隱窩底部不斷累積，最后突出腸腔形成腺瘤，這與中醫(yī)痰濕凝聚成塊病機(jī)相似。GEO 數(shù)據(jù)庫擁有目前大量關(guān)于CRA 基因芯片數(shù)據(jù)，這使我們嘗試尋找治療該病的靶基因成為可能。我們嘗試①②交集獲得相同對應(yīng)的靶點(diǎn)基因，得到MYC、HNF4A、GCG 3個(gè)潛在靶基因，我們通過對這3個(gè)靶基因擴(kuò)展相關(guān)基因范圍后進(jìn)行生物信息分析，生物過程GO 富集發(fā)現(xiàn)它們參與了生物高分子、細(xì)胞、基因表達(dá)正調(diào)節(jié)代謝過程，這符合上述的腺瘤形成與腸道干細(xì)胞異常分裂、增殖相關(guān)。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)靶點(diǎn)基因與各種癌癥、腫瘤形成相關(guān)，其中以MYC 為樞紐與結(jié)腸癌形成密切相關(guān)，而結(jié)腸癌公認(rèn)與CRA 的發(fā)生發(fā)展密切聯(lián)系，其中MYC與HNF4A 聯(lián)系緊密，同時(shí)存在于中藥成分亞麻酸中，后期經(jīng)文獻(xiàn)溯源發(fā)現(xiàn)原癌基因MYC 通過改變癌發(fā)生的腺瘤階段的代謝過程，MYC 的異常表達(dá)改變結(jié)直腸黏膜細(xì)胞代謝重編程而導(dǎo)致腺瘤、癌的發(fā)生發(fā)展，Satoh K 等［9］發(fā)現(xiàn)抑制MYC靶標(biāo)嘧啶合成基因如CAD，UMPS和CTPS等基因從而抑制細(xì)胞生長，因此MYC 是治療結(jié)直腸腺瘤、癌的潛在靶基因。有研究發(fā)現(xiàn)MYC、HNF4A 可能參與了細(xì)胞生長、周期調(diào)節(jié)和有絲分裂，影響疾病進(jìn)展［10］。M Darsigny等［11］研究發(fā)現(xiàn)HNF4A 是在腸道腫瘤發(fā)生過程中根除異常上皮細(xì)胞對ROS產(chǎn)生抗性的潛在治療靶點(diǎn)。有學(xué)者［12］通過本研究相同的方法，發(fā)現(xiàn)同正常黏膜基因表達(dá)水平相比，GCG 成下調(diào)趨勢，可以作為“腺瘤一癌序列”預(yù)后和疾病發(fā)展的觀察指標(biāo)。另外MYC、HNF4A、GCG 并不是CRA 的孤立靶基因，經(jīng)過分子功能GO 分析，它們均具有蛋白結(jié)合功能，參與CRA 形成過程，通過MCODE 網(wǎng)絡(luò)分析，它們以TP53為樞紐參與了結(jié)直腸腺瘤一癌序列過程。

綜上，通過生物信息分析及文獻(xiàn)溯源，我們得知MYC、HNF4A 參與了CRA 細(xì)胞生長、周期調(diào)節(jié)等過程，GCG 可作為CRA 疾病發(fā)展的觀察指標(biāo)，3個(gè)潛在靶基因以蛋白結(jié)合，以MYC 為樞紐、核心靶點(diǎn)參與了CRA 與結(jié)直腸癌形成過程，以上闡述杏仁、薏苡仁、半夏治療CRA 潛在機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供方向。受趙琦教授“疾病—病因—病機(jī)—方藥”思想和現(xiàn)代藥理學(xué)家通過藥物成分及結(jié)構(gòu)推知藥理作用啟發(fā)，本研究通過數(shù)據(jù)庫將CRA 患者與正常人黏膜組織差異基因群、三仁湯中具體中藥成分干預(yù)疾病基因群取交集后進(jìn)行GO、KEGG、網(wǎng)絡(luò)分析等生物信息分析，找到具體中藥治療CRA潛在基因靶點(diǎn)具有積極意義。然而此研究仍存在一些不足，第一從GEO 數(shù)據(jù)庫納入芯片數(shù)據(jù)較少，無法涵蓋所有CRA 患者與常人黏膜組織所有差異基因數(shù)據(jù)；第二從BATMAN、TCMSP收錄的杏仁、半夏、薏苡仁對應(yīng)的藥物成分及調(diào)節(jié)基因也有可能出現(xiàn)遺漏；第三獲得的潛在靶基因及相關(guān)蛋白人體內(nèi)受影響是多方面的，差異度大并不意味與CRA進(jìn)展與療效直接相關(guān)。這三點(diǎn)促使我們有必要在細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證與探索。