胡斌麗，丁宏偉，李 達

(遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563099)

鎘是一種常見的重金屬毒物，生物蓄積性強，半衰期長，毒性持久。大量文獻報道，鎘對機體多組織器官系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用[1-3]。睪丸是鎘的主要靶器官之一，與肝臟等其它器官相比，鎘更易導(dǎo)致睪丸損傷，有實驗證實對鎘有解毒作用的金屬硫蛋白(metallothionein，MT)的基因在睪丸內(nèi)不能被誘導(dǎo)表達或合成量不足[4]。鎘在雄性生殖系統(tǒng)方面的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點，動物實驗研究多限于親代，而對子代的影響鮮有報告，尤其是睪丸作為靶器官，在性成熟后生精功能是否發(fā)生改變、進而影響其生殖能力。為此，本實驗通過對大鼠孕期、哺乳期染鎘，分析其雄性仔鼠的生精功能，為進一步探討鎘的生殖毒性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用健康清潔級10周齡SD雌性大鼠40只，10周齡SD雄性大鼠20只，雌、雄體重為(220±15)g，由重慶陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 氯化鎘(CdCl2，分子量183.32，純度99%，購自sigma有限公司，為分析純)，M199培養(yǎng)基，勻漿液：0.5 mol/L NaCl，0.05% TritonX-100，0.25%硫柳汞混合液均為分析純(sigma有限公司)； Multiskan FC型Thermo酶儀(廣東丹利科技有限公司)；LKB-V超薄切片機(LKB生物有限公司)；721分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)；計算機輔助精子分析(CASA)儀(南寧松景天倫生物科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)AA240Z石墨爐原子吸收儀(澳大利亞vanian公司)。

1.3 分組與處理 實驗前，對動物室內(nèi)大鼠進行飼養(yǎng)，并觀察1周，無異常，于晚8時，雌雄按2∶l 的比例進行合籠，并于次日早晨8時，對雌鼠進行檢查，當出現(xiàn)陰栓或者陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子時，則判定為受孕，并記錄為受孕0 d,獲取孕鼠后獨籠喂養(yǎng)。隨機將孕鼠分為4個組,即對照組、低、中、高劑量染鎘組，每組5只。自孕鼠第1天，用超純水分別新鮮配制濃度為2、4、8mg/mL的氯化鎘(CdCl2)溶液，采用灌胃方式染毒，對照組用等量生理鹽水灌胃，低、中、高劑量組分別用對應(yīng)濃度氯化鎘灌胃(劑量分別為10、20、40 Mg/kg·d-1)，灌胃劑量為5 mL/( kg·d)，每天1次，直至哺乳期結(jié)束。待雄性仔鼠90日齡，從各組隨機抽取10只雄性仔鼠斷頭處死，待檢。

1.4 原子吸收法測定睪丸鎘含量 (1)勻漿液(STI液)的配置：0.5 mol/L NaCl，0.05% TritonX-100，0.25%硫柳汞加雙蒸水至1 000 mL。(2)標本制備：取左側(cè)睪丸組織少許，置10%甲醛液中固定過夜。準確稱取1g睪丸組織，加入制備的勻漿液(STI液)3 mL，4 ℃低溫勻漿，勻漿后4℃離心機離心，10 000 rpm，離心10 min，取上清液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?3)標本硝化：①用微量加樣器準確吸取500μL睪丸勻漿液于潔凈的50 mL燒杯中，加入10mL濃硝酸硝化過夜；②硝化過夜睪丸勻漿液置40℃烘干器中蒸干，加入少許稀硝酸洗凈燒杯中的殘留物，加稀硝酸定容至10mL備用，直接用于檢測。(4)樣本檢測：將制備好的樣本均取250 μL加入到樣品杯中，放置在原子吸收儀上檢測。

1.5 臟器系數(shù)、生精功能指標檢測 (1)臟器系數(shù)：動物處死后，立即摘取左、右睪丸，并稱重，計算臟器系數(shù)(睪丸/體重×100%)。(2)睪丸每日精子生成量：取右側(cè)睪丸，稱重，去除睪丸白膜后，在10 mL勻漿液(STI液)中，使用電動玻璃勻漿機破碎睪丸實質(zhì)組織，適當稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)不被破壞的精子細胞頭數(shù)，結(jié)果除以6.1即可算出每克睪丸每日精子生成量。(3)精子活動率和畸形率：處死動物后，使用眼科手術(shù)用剪刀，將附睪尾上的脂肪組織剔除，在37℃預(yù)溫的M199培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，沿著附睪尾的近側(cè)端、遠側(cè)端，使用一次性手術(shù)刀，剪至輸精管，深剪4～5刀，確保切口完全浸沒在培養(yǎng)液中，避免將精子暴露在空氣中。將含有精子的培養(yǎng)皿，放置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，精子擴散大約5 min，使精子從附睪尾中游出，將未充分擴散的大精子塊及殘余組織用尖頭鑷子剔除掉，取得精子懸液。使用M199培養(yǎng)液，按照1∶9進行稀釋，輕輕搖晃混勻，通過CASA儀，進行精子活動率的測定并觀察畸形精子數(shù)，并計算精子畸形率。(4)附睪精子計數(shù)：取右側(cè)附睪尾，稱重后充分剪碎，用生理鹽水定容至50 mL，再稀釋10倍后，用血球計數(shù)板法計數(shù)4大格精子數(shù)，除稀釋倍數(shù)后計算每克附睪尾組織的精子數(shù)。(5)睪丸組織病理切片檢查：HE 染色光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 各組睪丸重量、臟器系數(shù)比較 與對照組相比，低、中、高劑量組的睪丸重量和臟器系數(shù)有所降低(P<0.05)，與低劑量組相比，中、高劑量組的睪丸重量和臟器系數(shù)都有所降低(P<0.05)。與中劑量組相比，高劑量組的睪丸重量和臟器系數(shù)都有所降低(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組睪丸重量、臟器系數(shù)

*：與對照組相比，P<0.05；&：與低劑量相比，P<0.05；#：與中劑量組相比，P<0.05。

2.2 各組睪丸鎘含量的比較 各組睪丸鎘含量比較見表2和圖1。低劑量組睪丸鎘含量比對照組高(P<0.05)，中、高劑量組睪丸鎘含量明顯比對照組高(P<0.01)。與低劑量組相比，中劑量組的睪丸鎘含量增高(P<0.05)，高劑量組的睪丸鎘含量明顯增高(P<0.01)。高劑量組睪丸鎘含量大于中劑量組(P<0.05)。

2.3 各組睪丸生精功能指標的比較 與對照組相比，低劑量組的每日精子生成量、精子活動率、附睪精子計數(shù)降低，精子畸形率升高(P<0.05)，中、高劑量組變化明顯(P<0.01)。與低劑量組相比，中劑量組的每日精子生成量、精子活動率、附睪精子計數(shù)降低，精子畸形率升高(P<0.05)，高劑量組變化明顯(P<0.01)。與中劑量組相比，高劑量組的每日精子生成量、精子活動率、附睪精子計數(shù)明顯降低，精子畸形率明顯升高(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表2 各組睪丸鎘含量

*：與對照組相比，P<0.05；&：與低劑量相比，P<0.05；#：與中劑量組相比，P<0.05；a：與對照組相比，P<0.01；b：與低劑量相比，P<0.01。

圖1 各組睪丸鎘含量比較

表3 各組睪丸每日精子生成量、精子活動率、附睪尾精子計數(shù)和精子畸形率的比較

*：與對照組相比，P<0.05；&：與低劑量相比，P<0.05；#：與中劑量組相比，P<0.05；a：與對照組相比，P<0.01；b：與低劑量相比，P<0.01。

2.4 各組睪丸病理切片光鏡檢查結(jié)果比較 對照組睪丸組織層次分明、結(jié)構(gòu)完整，曲細精管上皮各級生精細胞排列緊密，睪丸間質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，見有正常的間質(zhì)細胞，管腔內(nèi)有較多量精子；與對照組相比，氯化鎘低劑量組睪丸大部分曲細精管變化不大，僅有少數(shù)曲細精管生精細胞層次減少；中、高劑量組曲細精管呈不同程度的萎縮、變性，管內(nèi)生精細胞數(shù)少或缺如，無精子形成或極少，管腔內(nèi)可見壞死的細胞碎片，而且高劑量組病變更加嚴重。結(jié)果見圖2。

A：對照組；B：氯化鎘低劑量組；C：氯化鎘中劑量組；D：氯化鎘高劑量組；×400。圖2 仔鼠睪丸病理切片分析

3 討論

鎘普遍存在于煙草和工業(yè)廢水中，是污染環(huán)境的重金屬毒物之一，同時，它還可以通過食物鏈，直接或者間接在人體中蓄積，對生殖系統(tǒng)造成不同程度地損傷[5]。有報道稱，鎘損傷了睪丸結(jié)構(gòu)和精子的形成，并表現(xiàn)為明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系[6]，由于鎘對生殖系統(tǒng)的毒性作用，導(dǎo)致精子數(shù)量減少和質(zhì)量下降，將會造成雄性不育和雌性早產(chǎn)或流產(chǎn)。因此，研究孕期和哺乳期鎘染毒對雄性仔鼠的生精功能的影響，為進一步探討鎘的生殖毒性提供參考依據(jù)。

在生殖毒理學(xué)實驗中，觀察實驗動物的體重變化及測定睪丸的重量和臟器系數(shù)，是一個經(jīng)濟、靈敏且有效的指標，能夠較好地反映化學(xué)毒物對該臟器的綜合毒理作用。在本實驗各染毒劑量組中，與對照組相比，低、中、高劑量組睪丸重量和臟器系數(shù)均降低，說明鎘暴露對SD雄性仔鼠睪丸發(fā)育有一定影響。本研究還發(fā)現(xiàn)SD雄性仔鼠睪丸組織發(fā)生病理學(xué)改變，其病理變化是導(dǎo)致雄性仔鼠生殖功能改變的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，表明鎘對雄性仔鼠存在生殖毒性，同時也證實了睪丸是鎘作用的重要靶器官，其可能機制是氯化鎘染毒后，通過母體的胎盤屏障向子代轉(zhuǎn)移鎘并在睪丸蓄積，對睪丸造成損傷，導(dǎo)致生殖器官的發(fā)育受到了抑制[7-8]。每日精子生成量、精子活動度、附睪尾精子計數(shù)和精子畸形率是評價生精功能精子質(zhì)量中常用指標之一，與對照組相比，各染鎘組SD雄性仔鼠每日精子生成量、精子活動度、附睪尾精子計數(shù)均下降，精子畸形率增加，高劑量染鎘組﹥中劑量染鎘組﹥低劑量染鎘組，表明鎘對SD雄性仔鼠生精細胞生長和發(fā)育產(chǎn)生了毒性作用，隨劑量增加，毒性作用增大；其機制可能是在精子形成期，鎘對生長因子和相關(guān)生精酶的活性產(chǎn)生抑制作用，也可能是睪丸組織細胞結(jié)構(gòu)受損導(dǎo)致睪丸萎縮或性激素睪酮的活性受到抑制作用而影響精子的正常發(fā)育[9-10]，從而導(dǎo)致生精功能受損。

綜上所述，SD大鼠孕期、哺乳期鎘暴露，可降低子代雄性大鼠的精子質(zhì)量，可能影響生育功能。