周洋 章帆 徐湛湛 孫琦 應(yīng)居正 徐營

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

在生活中人類接觸香煙煙霧的機(jī)會巨大，據(jù)報道，香煙煙霧中有超過5000種的化合物，已經(jīng)確定的致癌化合物多達(dá)60種，主要包括多環(huán)芳烴(如苯并芘)、亞硝胺和芳香胺等[1]。有研究表明，香煙煙霧中的這些有害物質(zhì)可引起顆粒細(xì)胞中一些基因表達(dá)的變化，使卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且凋亡的發(fā)生與線粒體的功能變化密切相關(guān)。

1 香煙煙霧對女性生殖影響的現(xiàn)狀

盡管目前全球成年女性吸煙人數(shù)低于男性，但多數(shù)國家女性吸煙人數(shù)表現(xiàn)出上升趨勢，即使不吸煙，女性暴露于香煙煙霧的危險亦不容忽視。我國女性被動吸煙人數(shù)巨大，大多數(shù)女性都有不同程度香煙煙霧接觸史，且人數(shù)遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國家水平[2]。有流行病學(xué)研究顯示長期暴露于香煙煙霧中，女性的卵巢結(jié)構(gòu)和功能會發(fā)生變化，生殖能力會受到影響。Mohammad等對此進(jìn)行了研究，證明了香煙煙霧暴露能夠?qū)ε陨衬芰υ斐蓳p傷[3]。香煙中含有焦油、煙堿、CO、醛類等有害的物質(zhì)，可通過氧化等機(jī)制對女性卵巢產(chǎn)生傷害。有研究將關(guān)注點聚焦于顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些有害物質(zhì)使卵泡中顆粒細(xì)胞的自噬小體增加，顆粒細(xì)胞自噬作用增強(qiáng)，導(dǎo)致卵泡數(shù)量減少，卵泡成熟率降低，進(jìn)而卵巢質(zhì)量下降，影響女性生殖能力[3]。

2 香煙煙霧對卵巢顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間作用的影響

卵母細(xì)胞由卵原細(xì)胞發(fā)育而來，出生后的女性卵巢卵母細(xì)胞經(jīng)歷了初級卵母細(xì)胞和次級卵母細(xì)胞階段，其發(fā)生與發(fā)育的基本單位為卵泡。在正常生理功能下，顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞處于同一個微環(huán)境中，顆粒細(xì)胞由卵泡細(xì)胞發(fā)育而來，且隨著卵母細(xì)胞發(fā)育，顆粒細(xì)胞能夠分化出卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞在兩種細(xì)胞作用下發(fā)育生長[4]。卵丘細(xì)胞主要起著支持卵母細(xì)胞發(fā)育的作用，并提供能量給卵母細(xì)胞。同時，卵丘細(xì)胞還參與調(diào)控了卵泡成熟的變化過程。顆粒細(xì)胞能夠分泌促卵泡刺激素(Follicule-stimulating hormone，F(xiàn)SH)受體和黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)受體等多種激素受體，同樣能夠作用于卵母細(xì)胞。不僅如此，顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間存在著旁分泌和間隙連接[5]，在生理情況下，兩者相互影響。香煙煙霧中含有醛類等有害物質(zhì)，能活化顆粒細(xì)胞內(nèi)多種酶，產(chǎn)生內(nèi)源性ROS，而使顆粒細(xì)胞內(nèi)氧化增強(qiáng)，造成線粒體在氧化作用下?lián)p傷[6]。線粒體產(chǎn)能減少，獲得能量不足，使顆粒細(xì)胞功能受損。香煙煙霧亦能通過影響mfn1/2和PARKIN表達(dá)破壞線粒體。在香煙煙霧提取物作用下mfn1/2表達(dá)下降，線粒體融合障礙，線粒體功能結(jié)構(gòu)破壞[7]；PARKIN表達(dá)升高，主要通過增強(qiáng)自噬作用使線粒體和顆粒細(xì)胞受損[8]。

同時顆粒細(xì)胞能夠產(chǎn)生生長因子，通過顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間的細(xì)胞連接，將其包含的信息傳遞給卵母細(xì)胞。當(dāng)顆粒細(xì)胞功能受損，顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的生長因子減少，對卵母細(xì)胞作用減弱，顆粒細(xì)胞傳遞給卵母細(xì)胞的信息減少[9]，使卵母細(xì)胞發(fā)育和功能下降，從而對女性的生育功能產(chǎn)生影響。香煙煙霧水溶物亦能直接影響顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間的細(xì)胞連接。長期暴露于香煙煙霧水溶物中，香煙中的尼古丁等成分可以進(jìn)入顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的細(xì)胞連接中，同樣使顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞信息傳遞減少，造成卵母細(xì)胞發(fā)育受到抑制和卵泡細(xì)胞減數(shù)分裂混亂[10]。

3 香煙煙霧對顆粒細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響

正常情況下，顆粒細(xì)胞能分泌相關(guān)因子如抑制素(Inhibin，INH)、雌二醇(Estradiol，E2)、胰島素樣生長因子(Insulin like growth factor，IGF)等，對卵泡生長和發(fā)育起調(diào)節(jié)作用。香煙煙霧水溶物通過氧化損傷和影響PINK1/PARKIN和mfn1/2基因的表達(dá)，造成顆粒細(xì)胞功能下降，顆粒細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的INH、E2和IGF減少，使卵母細(xì)胞發(fā)育受影響，從而使生殖能力下降。

香煙煙霧水溶物使顆粒細(xì)胞中抑制素α亞基基因表達(dá)產(chǎn)生的INH減少，通過負(fù)反饋抑制使FSH分泌下降。同時在卵巢上存在激活素受體，抑制素在多糖的作用下，通過細(xì)胞表面的TGF-β超家族與激活素相互作用，與激活素競爭結(jié)合激活素受體，使激活素的活化作用減弱。由于在正常卵巢中，激活素能夠促進(jìn)下丘腦釋放促性腺激素釋放激素，垂體促卵泡激素生成，當(dāng)激活素活化受抑制，F(xiàn)SH合成減少。香煙煙霧水溶物通過影響FSH合成，使卵泡的發(fā)育受阻[11]。

雌二醇(Estradiol，E2)能促進(jìn)顆粒細(xì)胞卵泡刺激素受體的表達(dá)，同時抑制顆粒細(xì)胞凋亡。香煙煙霧水溶物使雌二醇產(chǎn)生減少，雌二醇的作用靶點之一為顆粒細(xì)胞，其使顆粒細(xì)胞細(xì)胞膜上卵泡刺激素受體的表達(dá)減少，抑制顆粒細(xì)胞凋亡作用減弱，造成顆粒細(xì)胞凋亡[12]。

胰島素樣生長因子(Insulin like growth factor，IGF)能促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，亦能使細(xì)胞凋亡能力減弱。在竇前卵泡和竇卵泡的顆粒細(xì)胞中IGF-1生長因子量較高，香煙煙霧水溶物使IGF表達(dá)減少，使顆粒細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)，卵泡發(fā)育受到抑制。同時有研究表明FSH和雌二醇能夠促進(jìn)IGF-1的合成[12]，香煙煙霧水溶物可以通過減少抑制素、雌二醇分泌，降低IGF-1的合成，影響卵泡的發(fā)育。

4 香煙煙霧對顆粒細(xì)胞線粒體的影響

研究表明，香煙煙霧水溶物使顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)呈空泡狀改變，嵴退行性變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)變異，該變化主要影響PARKIN和mfn1/2基因表達(dá)的變化，通過線粒體影響顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致旁分泌產(chǎn)生的生長因子減少，以及對卵母細(xì)胞信息傳遞減弱，影響女性生育能力[13～14]。

4.1 香煙煙霧線粒體數(shù)量結(jié)構(gòu)的影響

線粒體是一種存在于細(xì)胞中的由兩層膜包被的細(xì)胞器，其基質(zhì)內(nèi)含有和細(xì)胞呼吸代謝相關(guān)的酶，能產(chǎn)生供細(xì)胞生理活動所需要的ATP，為細(xì)胞生命活動直接提供能量，在新陳代謝旺盛的細(xì)胞中線粒體居多。正常情況下，卵巢生理活動活躍需要大量的能量，所以在正常顆粒細(xì)胞中包含了大量的線粒體。香煙煙霧水溶物引起卵巢早衰時，細(xì)胞代謝減弱，所需能量減少，在顆粒細(xì)胞中mfn1/2表達(dá)下降，PARKIN表達(dá)升高后，引起線粒體自噬，線粒體數(shù)量減少，進(jìn)而可通過觀察線粒體數(shù)目了解香煙煙霧對顆粒細(xì)胞的影響，進(jìn)一步可見其對卵巢生理活動的影響。在計數(shù)線粒體數(shù)目時，由于每個線粒體中含有1-2套mt DNA，所以可以利用 mt DNA的數(shù)量來估計線粒體的數(shù)量[15]。當(dāng)線粒體數(shù)量減少，顆粒細(xì)胞能量不足，而造成顆粒細(xì)胞功能下降。

線粒體結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)分為四層結(jié)構(gòu)，外膜光滑，內(nèi)膜向內(nèi)褶皺可形成線粒體嵴。在年輕的顆粒細(xì)胞線粒體中具有完整的管狀嵴，在年老的顆粒細(xì)胞中線粒體則表現(xiàn)為空泡狀，嵴和基質(zhì)發(fā)生退行性變化或消失，出現(xiàn)電子致密物，線粒體發(fā)生破裂。通過電鏡觀察和IBAS圖像分析儀研究表明，長期接觸香煙煙霧水溶物，引起線粒體腫脹變形，嵴不完整甚至消失，線粒體表現(xiàn)出空泡化且膜發(fā)生破裂[16～17]，香煙煙霧中存在尼古丁，芳香胺類等物質(zhì)，會引起線粒體氧化損傷和激活凋亡途徑，并且這種損傷程度隨著香煙煙霧水溶物濃度的增大而增加。同時香煙煙霧水溶物能使卵巢顆粒細(xì)胞中的自噬體增加，線粒體在自噬體的作用下受損[18]，使線粒體形態(tài)數(shù)量改變。香煙煙霧水溶物通過這幾種機(jī)制共同影響線粒體形態(tài)，使線粒體功能下降，產(chǎn)能減少，影響顆粒細(xì)胞功能。

4.2 香煙煙霧對mfn1/2表達(dá)的影響

在顆粒細(xì)胞內(nèi)有線粒體融合蛋白1和線粒體融合蛋白2兩種亞型，它們分別由mfn1和mfn2基因編碼，均勻位于線粒體外膜，兩者在N末端有GTP酶結(jié)構(gòu)域，C末端有跨膜區(qū)，該特殊結(jié)構(gòu)能促進(jìn)線粒體融合蛋白1和線粒體融合蛋白2與線粒體外膜結(jié)合，它們對觸發(fā)線粒體融合起重要作用[7]。

mfn1/2在顆粒細(xì)胞中可以通過調(diào)控顆粒細(xì)胞體內(nèi)線粒體融合蛋白-1和融合蛋白-2的表達(dá)影響細(xì)胞的能量代謝[19]。香煙煙霧水溶物造成mfn1/2基因表達(dá)下降時，引起線粒體膜電位降低，影響線粒體呼吸鏈復(fù)合體亞單位結(jié)構(gòu)及相關(guān)酶活性，使顆粒細(xì)胞有氧代謝減弱，使細(xì)胞由原來的糖攝取轉(zhuǎn)為糖酵解和糖原合成率降低[20]，細(xì)胞供能不足，功能受損。

mfn1/2在顆粒細(xì)胞中不僅影響著顆粒細(xì)胞能量代謝，同時保持線粒體的正常結(jié)構(gòu)。mfn1/2表達(dá)產(chǎn)生的線粒體融合蛋白1和線粒體融合蛋白2能夠維持線粒體正常的三位網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，長期暴露于香煙煙霧水溶物后，mfn1和mfn2基因表達(dá)下降，會使線粒體出現(xiàn)膜分裂，導(dǎo)致線粒體由正常的管狀連接膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分裂成小球大泡狀膜結(jié)構(gòu)[21]，并且出現(xiàn)沒有規(guī)律的布朗運(yùn)動，而使線粒體功能障礙。

mfn1和mfn2不僅在線粒體外膜上表達(dá)，同時還在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上表達(dá)。在線粒體外膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，線粒體融合2蛋白1和線粒體融合蛋白2可以聚合形成異源二聚體或者線粒體融合蛋白2自我形成同源二聚體，在兩者的作用下，介導(dǎo)著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體間的相互作用[22]。長期暴露于香煙煙霧水溶物后，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的二聚體形成減少，使線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合力下降，形態(tài)發(fā)生改變，線粒體代謝減弱。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體共同影響卵巢顆粒細(xì)胞功能，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟。

4.3 香煙煙霧對PARKIN表達(dá)的影響

PARKIN是由Parkin2基因編碼的蛋白質(zhì)，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，這種蛋白質(zhì)具有E3泛素-蛋白連接酶活性，能通過泛素-蛋白酶系統(tǒng)來降解細(xì)胞內(nèi)異常的折疊蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能，發(fā)揮保護(hù)作用[23]，同時能通過PINK1-PARKIN信號通路[24]，協(xié)調(diào)控制線粒體的自噬發(fā)生[25]。線粒體自噬是一種選擇性清除失用線粒體的自噬過程，調(diào)節(jié)著細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量和正常功能，影響著機(jī)體內(nèi)的多種生理過程，該自噬過程主要由Atg基因調(diào)節(jié)[26]。

在正常情況下，Parkin2基因表達(dá)較低，線粒體自噬發(fā)生障礙，當(dāng)長期暴露于香煙煙霧水溶物后，Parkin2基因表達(dá)增加，通過PINK1-PARKIN信號通路誘導(dǎo)線粒體自噬體產(chǎn)生，降解被香煙煙霧水溶物氧化損傷的線粒體，使其功能下降而影響顆粒細(xì)胞功能，進(jìn)而減弱旁分泌對卵母細(xì)胞的作用，使與卵母細(xì)胞之間的信息傳遞障礙造成卵母細(xì)胞功能變化。在該通路中PARKIN中必須依賴PINK1轉(zhuǎn)移到線粒體，才能發(fā)揮PARKIN的自噬作用[8]。

PARKIN除了通過自噬影響線粒體形態(tài)功能外，還能磷酸化線粒體融合蛋白。香煙煙霧水溶物通過影響氧化應(yīng)激，能使線粒體功能障礙、基因完整性受損、膜電位下降，促使PARKIN聚集到受損傷的線粒體上。PARKIN在線粒體上使融合蛋白2泛素化[27]，泛素化修飾的mfn2能抑制線粒體融合，mfn2在香煙煙霧水溶物誘導(dǎo)下被PARKIN泛素化，可造成線粒體的融合障礙，線粒體碎片化，受損傷的線粒體單獨存在，引起線粒體的功能障礙。香煙煙霧水溶物引起的mfn2泛素化和線粒體碎片化同樣也能增強(qiáng)線粒體的自噬作用，導(dǎo)致線粒體數(shù)量、結(jié)構(gòu)的改變[28]。線粒體功能下降，顆粒細(xì)胞獲能不足，同樣能降低顆粒細(xì)胞功能，影響卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟進(jìn)而對女性生殖能力造成不利影響。

5 展望

已有研究表明，香煙煙霧能夠減少mfn1/2表達(dá)和增加PARKIN表達(dá)，通過影響線粒體間融合和自噬機(jī)制而損傷線粒體的結(jié)構(gòu)和功能[16,17,29]，間接使顆粒細(xì)胞受損；同時香煙煙霧也可減少顆粒細(xì)胞生長因子的分泌[11,12]，在兩種機(jī)制作用下通過影響顆粒細(xì)胞功能而造成卵母細(xì)胞受損，共同作用使女性卵巢功能受影響。

近年來由于香煙煙霧暴露于女性機(jī)會增加，國內(nèi)外學(xué)者對此影響進(jìn)行了一定的實驗研究，但是對香煙煙霧水溶物與卵巢顆粒細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)影響的研究仍然不夠深入，仍值得進(jìn)一步研究。研究香煙煙霧水溶物對卵巢顆粒細(xì)胞的影響，對女性的生殖意義重大，能為女性不孕和女性的卵巢早衰研究提供理論依據(jù)。