宋 丹，孫欣榮

1．西安醫(yī)學院(西安710068)；2.西安市兒童醫(yī)院(西安710003)

1 介 紹

流行性感冒是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，可致較高的發(fā)病率和病死率。鑒于目前的疫苗和抗病毒藥物治療的局限性，預(yù)防性治療旨在增強多方面的先天免疫力。免疫調(diào)節(jié)策略用來增強對甲型流感病毒(IAV)感染的先天免疫力，以減少肺損傷，或提高疫苗接種的療效。模式識別受體(PRR)能夠識別病原相關(guān)分子模式(PAMP)從而區(qū)分病原微生物與機體自身[1]，觸發(fā)這些受體引起的保護性反應(yīng)以誘導抗病毒宿主防御系統(tǒng)來提供立即的，短期的，以及持久的，特定的免疫。

2 模式識別受體

IAV被至少3個不同類別的PRR細胞識別，包括Toll 樣受體(TLR)，RIG-I樣受體(RLR)和具有核苷酸結(jié)合寡聚域的NOD 樣受體(NLR)。TLR是一種膜結(jié)合受體，為Ⅰ型跨膜蛋白，胞外區(qū)為富含亮氨酸的重復序列，胞內(nèi)區(qū)具有與Toll和白細胞介素1(IL-1)受體家族同源的結(jié)構(gòu)域TIR[2]。TLR配體包括廣泛的微生物組分，如脂質(zhì)和脂肽(TLR2/TLR1，TLR2/TLR6，TLR4)，蛋白質(zhì)(TLR5)和核酸(TLR3,7,8,9)。除了TLR3之外，大多數(shù)TLRs信號通過MyD88依賴的途徑來誘導促炎癥基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，包括I型干擾素，細胞因子，和共刺激分子。TLR3使用TRIF和不同的信號級聯(lián)激活促炎基因的轉(zhuǎn)錄。TLR的表達方式根據(jù)細胞類型不同而不同，TLR2、4在巨噬細胞、B細胞、DC中高表達。TLR7、9在漿細胞樣DC中高度表達。TLR的激活在抗菌和抗病毒免疫中都是重要的，TLR信號所需的蛋白質(zhì)突變導致免疫缺陷和廣泛的感染易感性增加。RLR是細胞內(nèi)PRR家族，可識別病毒來源的RNA來啟動先天性免疫信號級聯(lián)。 RLR在上皮細胞、成纖維細胞和一系列造血細胞中是至關(guān)重要的病毒感染的傳感器。它包括3名成員：RIG-I，MDA-5基因和LGP-2。 RIG-I識別5＇-三磷酸未加帽的ssRNA，這是許多病毒的共同特征，還可以識別短鏈dsRNA-這可以是病毒復制的副產(chǎn)物。MDA-5結(jié)合長鏈dsRNAs，這由病毒產(chǎn)生，但通常不在宿主細胞中產(chǎn)生。目前，關(guān)于LGP-2的知之甚少。RIG-1和MDA5 是細胞漿內(nèi)的主要抗病毒分子。NLR具有兩個亞類: 包括5個成員(NOD1-5)的 NOD家族和包括14個成員的NALP家族。NALP蛋白可通過形成復雜蛋白質(zhì)復合物-炎癥小體, 來活化促炎癥胱冬酶[3],來調(diào)節(jié)先天免疫，炎性小體的功能是上調(diào)IL-1β和IL-18的分泌。NLRP3是最有特點的炎癥復合體，并在對微生物(包括病毒)的刺激和細胞損傷的反應(yīng)上有關(guān)鍵作用，其包括NLRP3、接頭蛋白ASC、胱冬酶-1。炎性體激活需要兩個步驟，第一信號由TLR，IL-1受體和TNFR信號傳導介導并激活編碼NLRP3 pro-IL-1β和pro-IL-18的基因的轉(zhuǎn)錄，導致IL-1β、IL-18和炎性小體的其他組分的合成。共生菌群激活信號1，并因此使宿主細胞對進一步的細胞損傷或感染做出反應(yīng)。信號2是細胞壓力，這是通過改變離子通量、釋放線粒體ROS或能量代謝物、溶酶體蛋白酶來感知的，導致NLRP3炎癥小體的裝配、胱冬酶1的激活和IL-1β 、IL-18的分泌。病毒蛋白和ssRNA以被表明激活炎性小體，因為它們干擾正常細胞功能的能力。

3 細菌的免疫調(diào)節(jié)作用

3.1 先天性免疫力限制IAV感染 氣道微生物群將有可能在氣道病原體調(diào)節(jié)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。用特定細菌定殖或感染可以限制IAV通過生產(chǎn)微生物產(chǎn)物直接感染。例如，由表皮葡萄球菌產(chǎn)生的一種巨大的細胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白被證明阻斷IAV的感染。此外，通過細菌產(chǎn)物的粗制混合物刺激先天性免疫，已被證明為限制流感病毒生長及死亡率的免疫調(diào)節(jié)策略，例如，鼻內(nèi)給予嗜血桿菌、流感裂解物，霍亂毒素，CpG DNA或修飾的來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素(LTK63)，對小鼠隨后的IAV感染有顯著的保護作用。

3.2 細菌源性的產(chǎn)物 預(yù)防和治療TLR2和TLR4是TLR 家族中研究最早也是目前研究最清楚的成員之一， 在 LPS 介導的炎癥反應(yīng)中起主要作用[4]。TLR2是革蘭陽性菌的主要識別受體，也能識別LPS并介導細胞LPS反應(yīng)[5]。鼻內(nèi)施用合成的TLR2激動劑，如Pam2Cys或Pam3CSK4已被報道會引發(fā)肺部的炎癥反應(yīng)和先天性反應(yīng)，保護其免受IAV感染，并減少了其在IAV感染小鼠中的傳播。這種保護的具體機制尚不清楚。

TLR4與細菌細胞壁的成分結(jié)合，或與天然TLR4配體如LPS、合成的激動劑如脂質(zhì)A模擬物結(jié)合。LPS刺激巨噬細胞后激活的SR-A可抑制TLR4誘導的細胞活化，從而降低炎癥因子的釋放[6]。另一方面，LPS通過激活的TLR4下游信號轉(zhuǎn)導使巨噬細胞SR-A表達上調(diào)[7]。有報道稱鼻內(nèi)用LPS以TLR4依賴性的方式保護小鼠，這是致死流感感染前3d最有效的管理。FimH已被報道激活一系列先天性免疫細胞，包括NK細胞、巨噬細胞和成纖維細胞，通過TLR4/MyD88依賴途徑以及重組FimH的陰道遞送與對抗小鼠生殖器HSV-2感染的TLR4-依賴的先天性保護有關(guān)。FimH介導的對IAV感染的保護反應(yīng)似乎是部分依賴于肺泡巨噬細胞。TLR4也在病毒感染巨噬細胞后激活PI3K-Akt 途徑，并誘導IFN產(chǎn)生，可能增加抗病毒活性。因此，藥理學調(diào)節(jié)TLR4也可能通過作用于PIK3-Akt軸，促進抗病毒活性。合成的脂質(zhì)A類似物，例如AGPs，解除了脂質(zhì)A免疫調(diào)節(jié)作用的毒性。當在IAV感染之前48h施用，幾種類型的AGPs在小鼠中提供了對IAV誘導的體重減輕和依賴TLR4方式的疾病的強有力的保護。

此外，用TLR4拮抗劑Eritoran治療小鼠，減少了IAV誘導的肺病理改變和病毒復制，從而改善生存。有趣的是，Eritoran的療效也依賴于TLR2，提示相互作用的組合可能增加了在IAV感染期間的保護作用。

TLR9在漿細胞樣和其他DC亞群、B細胞、巨噬細胞和單核細胞的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)表達，并結(jié)合細菌或病毒DNA中非甲基化的CpG二核苷酸，觸發(fā)先天反應(yīng)。用合成的非甲基化CpG、ODN或脂質(zhì)體包封的CpG ODN 在致死性IAV感染的前1～5d對小鼠進行鼻內(nèi)預(yù)處理，預(yù)防或減少IAV誘導的死亡率。有報告說，用TLR2/6激動劑(Pam2CSK4)或CpG ODN治療小鼠沒有保護其免受致死性IAV感染;然而，當兩種治療同時應(yīng)用，存活率顯著增加。在有輕度，間歇性哮喘的人類受試者，特定CpG ODN的霧化被報道是安全和具有藥理活性的，在過敏原入侵期間誘導外周血和痰細胞的IFN-γ和ISGs[8]。但治療并不抑制變應(yīng)原誘導的癥狀，如支氣管收縮或嗜酸性粒細胞增多等。

3.3 細菌衍生物：擴大接種策略 細菌毒素衍生的疫苗接種的佐劑主要有：如霍亂毒素B或大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素、TLR4激動劑(如MPL)及其衍生物、TLR2激動劑Pam2Cys、TLR5激動劑(如鞭毛蛋白)、TLR9激動劑(如CpG)等。

為了減少細菌毒素來源的佐劑的毒性，突變毒素或低劑量的霍亂毒素B已被有效地使用在鼠模型中[9]；在SE中制定的合成MPL-衍生物GLA被證明增強重組H5亞基疫苗在健康成人中的免疫原性。GLA-SE激活髓系DC產(chǎn)生高水平的Th1-促細胞因子并且當與病毒裂解疫苗結(jié)合時，通過抑制IL-10的產(chǎn)生，增強Th1細胞對流感的反應(yīng)[10]，暗示在現(xiàn)有流感疫苗中添加GLA-SE可能會改善功效。TLR2激動劑Pam2Cys可激活DC上表達的TLR2，誘導高水平的肽特異性CD8+T細胞并促進在繼發(fā)的IAV感染后的病毒清除及增強抗原依賴性免疫；在流感感染的情況下，TLR5激動劑(如鞭毛蛋白)已被作為佐劑研究，來增強對滅活流感疫苗的反應(yīng)以及在新型亞單位疫苗的研制。

4 限制IAV感染的先天性免疫的病毒的免疫調(diào)節(jié)

宿主細胞主要通過細胞模式識別受體識別病毒RNA或DNA來感知和對抗IAV和其他病毒。感受核酸的內(nèi)體PRR包括TLR3、TLR7/8和TLR9，而RIG-I、線粒體抗病毒信號蛋白、炎性體是細胞質(zhì)PRR。由病毒或病毒產(chǎn)物觸發(fā)的這些PRRs，可引起I型IFN的誘導，ISG的調(diào)節(jié)和促炎細胞因子和趨化因子的分泌;所有這些有助于有效的抗病毒反應(yīng)。

4.1 病毒來源的產(chǎn)物：預(yù)防和治療 TLR3是識別dsRNA的內(nèi)體PRR，誘導一系列有效的抗病毒反應(yīng)。Poly-IC是dsRNA合成的類似物，是最常用的實驗性TLR3激動劑。用Poly-IC對小鼠進行預(yù)防性治療保護其免受隨后的IAV感染。當通過鼻內(nèi)途徑輸送Poly-IC對于限制IAV誘導的疾病是有效的，沒有明顯的副作用，而全身性輸送導致輕度癥狀。

TLR7(小鼠和人)和TLR8(人類)在系統(tǒng)發(fā)生學上相關(guān)，內(nèi)體傳感器在漿細胞樣DCs和B細胞中表達，這可被病毒ssRNA、咪唑啉化合物、核苷類似物、siRNA刺激。在小鼠中用3M-011(一種合成的人類咪唑啉家族的TLR7/8配體)在IAV感染72h之前或感染6h后鼻內(nèi)給藥與肺病毒滴度急劇下降有關(guān)[11]。1V270的肺部給藥迅速誘導肺中先天性細胞因子、趨化因子，如肺CD11C+DCs的活化，為小鼠免受致命的IAV的攻擊提供保護[12]。

靶向IAV基因中的保守序列的siRNA已被用于抑制體外和體內(nèi)的病毒生長和IAV感染的動物模型中。改善IAV感染的能力可能是由于其誘導TLR7依賴性IFN-α應(yīng)答的能力。但是，有效的輸送到氣道是限制使用基于siRNA的方法來限制IAV誘導的疾病的主要因素，因為“裸”siRNA易在體內(nèi)降解。目前傳送載體包括在帶正電的聚合物或脂質(zhì)或脂質(zhì)體中包裹帶負電的siRNA、或?qū)iRNA與“類脂質(zhì)”絡(luò)合。盡管新型遞送系統(tǒng)有所發(fā)展，但siRNA被有效傳遞到上皮細胞-肺中IAV復制的主要部位，已被證明是困難的。

細胞溶質(zhì)RIG-I在啟動對抗病毒感染(通過識別攜帶5＇ppp或5＇pp的病毒RNA來激活I(lǐng)型IFN和促炎反應(yīng)來對抗病毒感染)的免疫應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵的作用。早期研究表明體外轉(zhuǎn)錄5＇ppp ssRNA可能通過RIG-I誘導IFN。然而，近期的研究表明dsRNA的平端與5＇ppp直接相鄰，這表明在體外轉(zhuǎn)錄ssRNA也可能形成dsRNA產(chǎn)物來激活RIG-1。5＇ppp ssRNA還可以用作預(yù)防劑以限制H5N1的復制和體外IAV的大流行。在細胞培養(yǎng)物和小鼠中，給一個IAV特異性siRNA增加一個5＇ppp，可有效抑制IAV感染[13]。

4.2 病毒衍生物：接種策略 用poly-IC和滅活的流感病毒裂解疫苗鼻內(nèi)給藥，誘導針對同源和異源IAV毒株的交叉保護性免疫應(yīng)答，而沒有poly-IC的免疫在小鼠中誘導很小的反應(yīng)。Poly-IC和相關(guān)的dsRNA ONs在小鼠中也被用作佐劑來介導TLR3依賴的DCs的激活，產(chǎn)生特異性CTL 。此外，小鼠用重組IAV核蛋白在poly-IC或dsRNA ONs存在下的接種免疫，其存活率較只接受重組核蛋白高。在減毒流感病毒接種后24h鼻內(nèi)接種poly-IC，導致呼吸道DC功能增強，引發(fā)抗IAVCD8+T細胞，以及中和抗體的產(chǎn)生。有趣的是，Poly-IC只有在疫苗接種24h后接種才能提高疫苗接種的效果。如果疫苗和Poly-IC同時被接種則廢除功效。polyIC的佐劑對流感病毒裂解疫苗的效應(yīng)通過增加TLR2配體酵母聚糖進一步增強。在體外，用poly-IC加酵母聚糖孵化DCs，導致有效的DC活化，并誘導一系列炎癥介質(zhì)，包括TNF-α，IL-6，IL-12，IFN-b和IL-10。

Poly-IC被批準用于人體，其核糖核酸酶穩(wěn)定形式，poly-ICLC，現(xiàn)在處于癌癥治療的I期和II期試驗中。poly-ICLC本身療效差，但與載體抗原DC相結(jié)合，已經(jīng)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中獲得可觀的結(jié)果。在人類中，poly-ICLC治療增加了IFN-α的產(chǎn)生、細胞因子和趨化因子的表達，并與激活DCs增強對腫瘤抗原的免疫反應(yīng)有關(guān)。PIKA是poly-IC的穩(wěn)定衍生物，已被申請作為對抗廣泛的Ags的疫苗的新佐劑 。在IAV的鼠標模型中，PIKA鼻內(nèi)治療可能參與減少肺中病毒滴度[14]。

5 限制IAV感染的先天性免疫的炎性免疫調(diào)節(jié)

5.1 炎性體衍生物：預(yù)防和治療應(yīng)用 在IAV感染的情況下，NLRP3炎性體在 IAV感染后被激活并在IAV感染的小鼠中引發(fā)的早期保護性先天應(yīng)答上發(fā)揮重要作用。有研究表明，用NLRP3炎性小體的一種小分子抑制劑-MCC950治療IAV感染的小鼠 ，如果治療延遲到高峰(如感染后d3)，會起保護作用[15]。NLRP3炎性體的預(yù)防性配體有腸道微生物群、TLR配體(如LPS)。

5.2 炎癥反應(yīng)產(chǎn)物 明礬是第一批被開發(fā)的佐劑之一，也是少數(shù)人類準許使用的佐劑之一。明礬導致溶酶體中斷。與單獨接種VLP的疫苗相比，VLP和明礬聯(lián)合使用可以增加H5N1病毒致死性感染后的老齡小鼠的生存率，暗示明礬可能是增加易感目標群體，如老人的免疫應(yīng)答的一個有效的策略。

6 展 望

在人類中，PRR刺激配體(如LPS，poly-IC)或促炎細胞因子的應(yīng)用導致誘導“流感樣”癥狀，限制了它們在治療疾病中的應(yīng)用。類似地，siRNA據(jù)報導誘導高水平的促炎細胞因子，提出關(guān)于他們在治療病理狀態(tài)的系統(tǒng)性使用的考慮[16]。poly-IC和Pam2Cys因為他們作為疫苗佐劑的翻譯能力獲得了更多的關(guān)注。詳細了解免疫興奮劑的保護作用的機制及流感感染在不同宿主、不同條件或并發(fā)癥、不同病毒株中的復雜的炎癥反應(yīng)是需要的。同時，開發(fā)調(diào)節(jié)先天免疫力的療法必須考慮有效的病毒清除與誘導免疫病理和疾病之間的微妙的平衡。