羅 斌，闕祖俊，姚嘉良，施奇惠，田建輝,＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科 上海 200032；2.上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)腫瘤研究所上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032）

據(jù)2019 年美國癌癥治療與生存統(tǒng)計(jì)報(bào)告資料顯示，非小細(xì)胞肺癌Ⅰ期患者的5年相對生存率為57%，而Ⅳ期患者的5 年相對生存率僅有4%[1]，提示積極阻斷早期肺癌的轉(zhuǎn)移發(fā)生是提高患者整體生存率的關(guān)鍵。但目前尚缺乏有效的干預(yù)手段[2]，其主要原因是對轉(zhuǎn)移發(fā)生的種子—血液和淋巴系統(tǒng)中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞—研究不夠深入。而目前針對原發(fā)灶病理和分子診斷結(jié)果設(shè)計(jì)的各種干預(yù)措施實(shí)質(zhì)上均缺乏精準(zhǔn)指導(dǎo)，這是導(dǎo)致目前仍缺乏抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的關(guān)鍵原因[2]。

目前大量臨床研究發(fā)現(xiàn)早期腫瘤患者，其外周血中已經(jīng)存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells,CTCs）[3]，且CTCs數(shù)目與疾病進(jìn)展和生存預(yù)后等相關(guān)[4]。課題組研究也發(fā)現(xiàn)，早期肺癌患者的外周血中存在較高數(shù)目的CTCs，提示需要盡早實(shí)施干預(yù)[5,6]。Zheng 等研究發(fā)現(xiàn)高達(dá)80%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者在原發(fā)腫瘤長至約10 mm3時(shí)，就已經(jīng)向機(jī)體的外周循環(huán)系統(tǒng)或遠(yuǎn)處臟器擴(kuò)散[7]。由于目前臨床上臨床上較為敏感的影響檢查PET/CT檢測PET-CT檢測下限為2 mm，因此腫瘤細(xì)胞簇或小于2 mm的病灶則無法被發(fā)現(xiàn)；而此時(shí)的患者體內(nèi)狀態(tài)正是復(fù)發(fā)的萌芽時(shí)期，誠如《道德經(jīng)》所述之“無”的狀態(tài)，后來發(fā)展至臨床可以檢測出病灶則是“無中生有”的過程。此外，Su 等[8]通過對小細(xì)胞肺癌患者外周血中的CTCs 進(jìn)行單細(xì)胞測序，研究發(fā)現(xiàn)CTCs 單細(xì)胞基因組測序可反應(yīng)腫瘤組織的基因突變狀況，且CTCs、轉(zhuǎn)移灶與復(fù)發(fā)腫瘤組織中的DNA 復(fù)制修復(fù)通路相關(guān)基因頻繁發(fā)生突變，提示基于外周血中的CTCs 基因突變狀態(tài)進(jìn)行治療策略的制定可能對腫瘤轉(zhuǎn)移防治具有一定的作用。故建立CTCs細(xì)胞系，研究CTCs 的生物學(xué)特性和鑒別出真正導(dǎo)致轉(zhuǎn)移發(fā)生的CTCs 亞群的分子特征，進(jìn)而基于該亞群的CTCs 開發(fā)抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物，使在外周循環(huán)階段的CTCs發(fā)生失巢凋亡或誘導(dǎo)已侵入靶器官的CTCs進(jìn)入靜止期?？傊?，CTCs 細(xì)胞系的建立是目前研發(fā)抗轉(zhuǎn)移藥物的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

1 建立首例人源非小細(xì)胞肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞系[9]

采集非小細(xì)胞肺癌患者外周血10 mL，通過離心去除富含血小板的血漿，用Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution,HBSS）重懸細(xì)胞后，加入包被有EpCAM 和EGFR 的免疫磁珠混合物進(jìn)行孵育，然后用HBSS 進(jìn)行稀釋后，將樣品通過魚骨形芯片，在魚骨形芯片上放置磁鐵用于捕獲結(jié)合了免疫磁珠的CTCs，沖洗非特異性結(jié)合的細(xì)胞，然后撤去磁鐵，收集CTCs[9]。

將捕獲得到的CTCs 轉(zhuǎn)移至低吸附的96 孔板中，并添加RPMI 1640培養(yǎng)基（含20 ng/mL上皮生長因子EGF，20 ng/mL堿性纖維生長因子FGF2，B27添加劑及1%的抗生素）于37℃、5%CO2、3%O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待CTCs開始增殖時(shí)轉(zhuǎn)至正常氧氣濃度下培養(yǎng)[9]。在嘗試對35 例NSCLC 患者的CTCs 進(jìn)行了分離和體外培養(yǎng)，最終來自于一位II期女性肺腺癌術(shù)后患者的CTCs被培養(yǎng)成功，建立了肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞系，命名為CTC-TJH-01，單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)CTC-TJH-01細(xì)胞來自于原發(fā)灶[9]。目前已對該細(xì)胞系申請了專利。

2 NSCLC外周血CTCs細(xì)胞系的生物學(xué)特性探索

2.1 CTC-TJH-01細(xì)胞具有休眠、干細(xì)胞表型和免疫逃逸的特性

為揭示CTC-TJH-01 細(xì)胞的生物學(xué)特性，課題組將其與原代肺癌細(xì)胞A549和95-D細(xì)胞進(jìn)行了比較研究。鏡下形態(tài)學(xué)觀測發(fā)現(xiàn)CTC-TJH-01 細(xì)胞核較大、核輪廓不規(guī)則、核仁突出、核質(zhì)比高，細(xì)胞大小顯著大于95-D 和A549 細(xì)胞。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)CTCTJH-01細(xì)胞增殖能力較弱，但與95-D和A549細(xì)胞相比，對順鉑和泰素帝的耐藥性更強(qiáng)[10]。此外，課題組還對CTC-TJH-01、95-D 和A549 細(xì)胞的表型進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)CTC-TJH-01細(xì)胞處于EMT的中間階段，同時(shí)高表達(dá)皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）和神經(jīng)元型鈣黏蛋白（N-cadherin），且具有高代謝、干細(xì)胞表型和免疫逃逸特征[10]。Laure 等在人結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞中也觀察到了相同的結(jié)果[11]。此外，我們還對CTCTJH-01 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CTCTJH-01 細(xì)胞低表達(dá)淋巴細(xì)胞招募相關(guān)趨化因子CX3CL1，高表達(dá)轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞因子CXCL5[10]。而前期大量研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CX3CL1的LLC細(xì)胞可招募CD8+T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞的浸潤，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤免疫活性，抑制腫瘤生長[12,13]。而臨床研究發(fā)現(xiàn)CXCL5 的表達(dá)水平與肺癌患者的無疾病進(jìn)展生存期和總生存期相關(guān)[14]，CXCL5可促進(jìn)肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。通過腫瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)CTCTJH-01細(xì)胞對T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的招募能力顯著弱于95-D和A549細(xì)胞；采用siRNA下調(diào)CTC-TJH-01細(xì)胞上CXCL5蛋白的表達(dá)可抑制其侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。

此外，課題組采用聚甲基丙烯酸羥乙基酯（poly-HEMA）建立了CTC-TJH-01 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)模型，研究發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)的CTC-TJH-01細(xì)胞具有自身聚集成可逆性的細(xì)胞團(tuán)塊，其結(jié)構(gòu)與類器官相似，此外還具有生長抑制、細(xì)胞周期阻滯、失巢凋亡抵抗和對化療藥物不敏感等生物學(xué)特征。Aceto 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，血液中的CTCs 細(xì)胞簇是單細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的20～50 倍，而采用鈉-鉀ATP酶抑制劑解離CTC細(xì)胞簇可抑制其轉(zhuǎn)移[17]，提示CTCs 形成細(xì)胞簇可能是其抵抗失巢凋亡進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制，表明基于CTC-TJH-01 細(xì)胞建立的類器官模型可用于抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的篩選。由此，課題組把阻止CTCs 聚集成簇和失巢凋亡并列為篩選有效藥物的評估指標(biāo)。

2.2 CTC-TJH-01體內(nèi)致瘤性和轉(zhuǎn)移能力評估

為證實(shí)肺癌患者來源的循環(huán)腫瘤細(xì)胞是否具有致瘤性和肺轉(zhuǎn)移能力，課題組采用模式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，將不同免疫背景的小鼠進(jìn)行CTC-TJH-01 移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞通過皮下接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，CTCTJH-01 細(xì)胞的致瘤率100%；與原代A549 細(xì)胞相比，CTC-TJH-01 細(xì)胞的腫瘤生長速度較慢，其結(jié)果與體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)相一致[10]。

此外，課題組還采用CTC-TJH-01 細(xì)胞在NOD/SCID小鼠上建立了皮下移植瘤肺轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果顯示CTC-TJH-01細(xì)胞形成的皮下移植瘤可以轉(zhuǎn)移到肺[10]。上述研究提示肺癌早期術(shù)后患者外周血中已經(jīng)存在的循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有致瘤性和轉(zhuǎn)移能力，它們可能是導(dǎo)致肺癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)鍵。然而目前這一觀點(diǎn)尚未受到足夠的重視，導(dǎo)致現(xiàn)有治療策略對于早期肺癌患者的總生存獲益有限。

2.3 NK細(xì)胞功能狀態(tài)與NSCLC外周血CTCs免疫逃逸密切相關(guān)

為進(jìn)一步驗(yàn)證CTC-TJH-01細(xì)胞是否具有轉(zhuǎn)移能力，采用不同免疫背景的小鼠進(jìn)行研究，其中包括免疫正常的C57BL/6 小鼠，T 淋巴細(xì)胞缺失的裸小鼠，以及同時(shí)缺少T 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞的NOD/SCID 小鼠。然后在相同的實(shí)驗(yàn)條件下通過尾靜脈注射將CTCTJH-01細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，由于小鼠品系及免疫背景不同，導(dǎo)致其肺部成瘤率也存在很大的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTC-TJH-01 細(xì)胞在C57BL/6 小鼠和裸小鼠的肺部均不成瘤，而在NOD/SCID 小鼠上肺部成瘤率100%[18]。提示小鼠外周血中存在的免疫細(xì)胞（如NK細(xì)胞）對CTC-TJH-01 細(xì)胞具有較大的排斥作用，而CTC-TJH-01細(xì)胞可能以休眠的狀態(tài)存活于裸小鼠的肺部，但有待進(jìn)一步驗(yàn)證。然而，Dewan等研究發(fā)現(xiàn)將人源乳腺癌細(xì)胞與NK 細(xì)胞共注射接種到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，可顯著抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[19]。而Alexander 等研究發(fā)現(xiàn)NK 細(xì)胞可通過釋放IFN-γ和TNF-α來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)[20]。Tobias 等也發(fā)現(xiàn)NK 細(xì)胞可通過穿孔素途徑誘導(dǎo)CTCs 休眠，進(jìn)而抑制肺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生[21]。此外，Taryn等研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的外周血中，CTCs數(shù)目越多，其NK細(xì)胞的殺傷活性越低[22]。而Mao 等研究發(fā)現(xiàn)基于NK 細(xì)胞的免疫治療可減少晚期非小細(xì)胞肺癌患者外周血中的CTCs數(shù)目[23]。上述研究均提示NK細(xì)胞的功能狀態(tài)與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而基于NK 細(xì)胞開展免疫治療可能對預(yù)防肺癌轉(zhuǎn)移具有一定的作用。

2.4 建立肺癌轉(zhuǎn)移類人源化小鼠模型

基于CTC-TJH-01細(xì)胞我們正在構(gòu)建模擬臨床肺癌轉(zhuǎn)移實(shí)際過程的小鼠體內(nèi)研究模型，即通過提取人外周血單核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC），然后將PBMC 與CTC-TJH-01 細(xì)胞混合后通過尾靜脈注射接種到NOD/SCID 小鼠體內(nèi)，進(jìn)而構(gòu)建可以體現(xiàn)腫瘤所處免疫內(nèi)環(huán)境的類人源化小鼠模型，基于該模型篩選抗肺癌轉(zhuǎn)移的藥物。

3 CTCs 細(xì)胞系的建立有助于將肺癌精準(zhǔn)治療的理念落實(shí)到早期術(shù)后轉(zhuǎn)移防治領(lǐng)域

轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致90%惡性腫瘤患者死亡的關(guān)鍵因素，目前防治肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的效率亟待提高[24]。其根本原因是缺乏對轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制的認(rèn)識和精準(zhǔn)干預(yù)。目前早期肺癌術(shù)后患者的治療如化療、生物靶向治療等均針對原發(fā)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，而作為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生種子的循環(huán)腫瘤細(xì)胞并沒有作為靶點(diǎn)。早在1869 年澳大利亞科學(xué)家Thomas Ashworth 在一例患者血液中發(fā)現(xiàn)CTCs 后，近20 年來，該領(lǐng)域發(fā)展迅速，CTCs 在肺癌的早期診斷、預(yù)后評估、藥物篩選領(lǐng)域都有重要價(jià)值[3]，已經(jīng)和ctDNA、外泌體等一起成為臨床液體活檢的重要組成部分[25]。因此，建立穩(wěn)定的循環(huán)腫瘤細(xì)胞系是突破肺癌轉(zhuǎn)移療效瓶頸的關(guān)鍵。

由于外周血中的CTCs數(shù)目極為稀少（每毫升血約含有1～100個(gè)CTCs）[26]，導(dǎo)致循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體外建系的難度極大，目前僅有乳腺癌、結(jié)直腸癌和小細(xì)胞肺癌等少數(shù)癌腫建立了循環(huán)腫瘤細(xì)胞系[11,27,28]。而我們課題組建立了非小細(xì)胞肺癌的循環(huán)腫瘤細(xì)胞系，并初步探索了它發(fā)生免疫逃逸和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

本研究建立穩(wěn)定的CTC-TJH-01細(xì)胞系對促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移研究具有重要意義。首先是課題組首次建立了人肺癌外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞系，豐富了腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究內(nèi)容。其次從中西醫(yī)融匯的角度，提出“正虛伏毒”為肺癌轉(zhuǎn)移的核心病機(jī)[29]，而CTC-TJH-01細(xì)胞的建立及其生物學(xué)特征的驗(yàn)證，是對“正虛伏毒”學(xué)術(shù)觀點(diǎn)的有力佐證，實(shí)踐了從臨床科學(xué)問題出發(fā)—提出科學(xué)理論—回歸臨床應(yīng)用的科學(xué)研究思路；最后，其重要的意義在于為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)理念指導(dǎo)早期肺癌術(shù)后的轉(zhuǎn)移預(yù)防提供了明確靶點(diǎn)，目前課題組正基于CTCTJH-01細(xì)胞篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移的中藥小分子化合物。