劉兆宇，胡臘，曾子成，林海，李明，易高，姚文霞

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣州510700)

慢性阻塞性肺病(COPD)是一種以氣流受限，且不完全可逆的一種常見病和多發(fā)病[1～3]。CODP的臨床特征往往表現(xiàn)為咳嗽、咳痰，并且伴隨有氣流受限、肺功能下降等病理特征。目前，COPD影響人口約3.3億，造成的經(jīng)濟成本約2.1萬億美元[4]。隨著大氣污染日益加重，煙草人群增多和人口老齡化等因素，預(yù)計到2020年COPD講發(fā)展為全球第三大死亡原因[5]。長久以來，COPD的發(fā)病機制并不十分清楚，涉及的機制比較復(fù)雜。一般認(rèn)為，COPD是一種慢性炎癥性疾病，以持續(xù)性氣道炎癥、肺功能惡化等為主要特征[6,7]。以往的大多數(shù)研究主要針對單個或數(shù)個基因與COPD相關(guān)性及生物學(xué)功能研究，盡管能闡明部分基因在COPD發(fā)展進(jìn)程中的作用，然而并不能全面的探究COPD的形成。近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展，高通量測序和基因芯片已經(jīng)在COPD、哮喘等疾病中有了廣泛的應(yīng)用，并為相關(guān)疾病的診斷、治療靶點提供了可靠的思路[8～10]。本研究通過生物信息學(xué)等方法篩選基因芯片GSE37768中COPD肺組織中差異表達(dá)基因，并分析COPD相關(guān)基因的功能以及構(gòu)建相關(guān)基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)行下一步研究COPD發(fā)生發(fā)展的分子機制提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)來源介紹 從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中下載COPD表達(dá)芯片GSE57148。該COPD表達(dá)芯片數(shù)據(jù)由漢城國立大學(xué)的JaeHyun Lim等上傳，包括98個COPD肺組織樣本(GSM1376077～GSM1376174)和91個正常肺組織標(biāo)本(GSM1375986～GSM1376076)，均為mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

1.2 COPD中差異表達(dá)基因分析 下載COPD表達(dá)譜芯片GSE57148的表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)探針后，通過R軟件(R version 3.5.0)對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后采用R軟件擴展包“DESeq”進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。

1.3 COPD差異表達(dá)基因基因本體功能富集分析及調(diào)控通路分析 基因本體(GO)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析是目前廣泛應(yīng)用于芯片數(shù)據(jù)分析的方法，能夠?qū)Υ笠?guī)模的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行功能分析和通路富集。我們采用R軟件擴展包“clusterProfiler”分析COPD中信號通路的富集情況，以P<0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，對差異基因進(jìn)行功能注釋，并分析其中涉及的相關(guān)通路。

1.4 COPD差異表達(dá)基因所調(diào)控蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵基因分析 STRING(https://string-db.org/)是常用來構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的工具。在最新版的數(shù)據(jù)中收集包含了5 090個物種中的24 584 628種蛋白之間的相互作用。我們將COPD中差異表達(dá)的基因?qū)氲絊TRING11.0數(shù)據(jù)庫中分析，并設(shè)置最低相互作用分值為0.4，獲得差異基因之間的相互作用關(guān)系。在STRING數(shù)據(jù)庫中獲得差異基因之間的相互作用關(guān)系后，將數(shù)據(jù)下載，然后通過Cytoscape(Version 3.7.1)進(jìn)行可視化，并通過相應(yīng)的插件“cytoHubba”分析獲得Hub基因。

2 結(jié)果

2.1 COPD肺組織中差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 通過對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以表達(dá)量變化2倍，P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，在COPD肺組織中我們發(fā)現(xiàn)117個基因為差異表達(dá)基因，其中發(fā)生上調(diào)的基因有63個，發(fā)生下調(diào)的基因有54個。以表達(dá)量變化1.5倍，P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，在COPD肺組織中有642個基因差異表達(dá)，其中380個基因發(fā)生上調(diào)，262個基因發(fā)生下調(diào)。差異表達(dá)基因中上調(diào)最明顯的為HIST1H4A、CCKAR、TCF23、COL11A1、CDKL5，分別上調(diào)了7.5倍、5.1倍、4.6倍、3.9倍和3.5倍；下調(diào)最明顯的基因為PRAMEF21、FAM21B、RTBDN、GPR89C和CSAG1，分別下調(diào)了21.9倍、16.8倍、13.5倍、9.8倍和8.1倍。

2.2 COPD差異表達(dá)基因的GO功能和調(diào)控通路分析結(jié)果 在分析COPD肺組織中的差異性表達(dá)基因后，采用GO分析和KEGG分析研究COPD中差異性表達(dá)基因參與的信號通路激活情況。首先，分析差異基因主要參與的生物學(xué)過程發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織(GO：0043062：extracellular structure organization)、細(xì)胞外基質(zhì)組織(GO：0030198：extracellular matrix organization)、妊娠中的母性過程(GO：0060135：maternal process involved in female pregnancy)、外部刺激的正向調(diào)控(GO：0032103：positive regulation of response to external stimulus)和膠原纖維組織(GO：0030199：collagen fibril organization)；主要分子功能為受體配體活性(GO：0048018：receptor ligand activity)、激素活性(GO：0005179：hormone activity)、細(xì)胞因子活性(GO：0005125：cytokine activity)、細(xì)胞色素c氧化活性(GO：0004129：cytochrome-c oxidase activity)和氧化還原活性(GO：0016676：oxidoreductase activity)；而主要細(xì)胞組份為線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV(GO：0005751：mitochondrial respiratory chain complex IV)、呼吸鏈復(fù)合物IV(GO：0045277：respiratory chain complex IV)、細(xì)胞外基質(zhì)(GO：0031012：extracellular matrix)、血小板α顆粒官腔(GO：0031093：platelet alpha granule lumen)和纖維狀膠原三聚體(GO：0005583：fibrillar collagen trimer)。

在以P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)下，KEGG信號通路富集分析表明COPD肺組織中差異性表達(dá)基因主要激活的信號通路有阿米巴蟲病(Amoebiasis)、精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)、補體與凝血級聯(lián)(Complement and coagulation cascades)、ECM受體相互作用(ECM-receptor interaction)和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)；主要抑制的信號通路有α-亞麻酸代謝(alpha-Linolenic acid metabolism)、醚酯代謝(Ether lipid metabolism)、核糖體(Ribosome)、亞油酸代謝(Linoleic acid metabolism)和Ras信號通路(Ras signaling pathway)。

2.3 COPD差異表達(dá)關(guān)鍵基因的篩選結(jié)果 為了通過分析COPD肺組織中差異表達(dá)基因來獲得相應(yīng)的調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)，找出與COPD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因，我們通過在線網(wǎng)站STRING分析差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和Hub基因。通過STRING數(shù)據(jù)庫，我們獲得了一份包含差異基因的433條互作關(guān)系的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。然后，將互作數(shù)據(jù)在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化和Hub基因確認(rèn)并展示出來，結(jié)果顯示Hub基因分別為VWF、FGG、IGF1、F5、RPS15、RPS12、SEC61B、THBS1和F13A1，它們之間存在較強的相互作用關(guān)系，可能是COPD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步探索COPD的發(fā)病機制、提供診斷和治療靶點提供基礎(chǔ)。

3 討論

COPD的形成是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，一般認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病，在發(fā)病過程中包括巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、中心粒細(xì)胞等多種細(xì)胞參與[11,12]。細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等方法是目前研究COPD的主要手段和方法，然而高通量測序、基因芯片結(jié)合生物信息的方法的應(yīng)用為我們從分子水平揭示COPD的發(fā)生、發(fā)展機制提供了可能[13,14]。在本研究中，我們采用生物信息學(xué)方法分析了COPD肺組織和正常肺組織中的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)變化2倍的基因有117個，變化1.5倍的基因有642個，并采用GO分析、KEGG分析了富集的信號通路，并通過蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析了COPD相關(guān)的關(guān)鍵基因。

在117個變化2倍的差異基因中，表達(dá)上調(diào)的有63個，表達(dá)下調(diào)的有54個，其中變化5倍的基因有15個。通過GO分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要參與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)形成、細(xì)胞外基質(zhì)形成、膠原纖維化和氧化還原活性等。細(xì)胞外基質(zhì)改變，纖維化和氧化還原活性提高是COPD的基本病理特征[15～17]。多項研究表明，COPD肺組織存在纖維化情況，與纖維化相關(guān)的基因出現(xiàn)高表達(dá)。Bihlet等發(fā)現(xiàn)，COPD患者中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶降解彈性蛋白，慢性炎癥誘導(dǎo)Ⅵ型膠原大量累積[18]，Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、Ⅳ型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白β2表達(dá)量增加[19]。

隨后，我們通過構(gòu)建蛋白—蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析一共發(fā)現(xiàn)了433條互作關(guān)系，獲得的Hub基因分別為VWF、FGG、IGF1、F5、RPS15、RPS12、SEC61B、THBS1、F13A1，其中FGG屬于纖維蛋白原家族成員，是系統(tǒng)性炎癥的標(biāo)志物。研究表明，fibrogen表達(dá)量的提高與肺功能降低、COPD發(fā)生的風(fēng)險增加[20,21]。Hub基因是蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，在生物學(xué)過程中可能發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用，因此針對這些基因的進(jìn)一步研究將可能為COPD的相關(guān)研究提供進(jìn)一步的思路。由于缺少臨床樣本，本研究才存在一定不足，下一步我們將收集相關(guān)臨床樣本，研究相關(guān)關(guān)鍵基因在COPD疾病進(jìn)程中的作用和相關(guān)機制。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)分析的方法對COPD高通量數(shù)據(jù)GSE57148進(jìn)行了分析，獲得了COPD肺組織中的差異表達(dá)基因。通過這這些差異基因的GO分析和KEGG信號通路富集分析，揭示了COPD肺組織中主要涉及的信號通路，并通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)初步構(gòu)建了VWF、FGG、IGF1、F5、RPS15、RPS12、SEC61B、THBS1、F13A1等為COPD相關(guān)的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步在細(xì)胞和分子水平研究COPD發(fā)生發(fā)展的分子機制提供指導(dǎo)，為后續(xù)COPD的臨床診治提供依據(jù)。