王雨佳，沈洪

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京 210000)

腸道是消化器官中最長的管道，與一系列腸道疾病有關，如慢性炎癥性腸病(IBD)、腸梗阻、痢疾、結直腸癌(CRC)等[1,2]。盡管大量腸疾病研究已在永生化細胞或動物模型中開展，但由于腸道不同部位的組織具有獨特的結構和生理功能，使用單一的離體細胞模型或動物模型，很難模擬人體腸道的結構、功能以及疾病發(fā)生過程，導致研究結果具有局限性。腸道是來源于內胚層的重要器官，2007年Clevers團隊首次證明LGR5+干細胞位于腸道隱窩的基部，形成腸道干細胞的生態(tài)位，可分化形成腸道上皮細胞，如腸細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和內分泌細胞[3]。隨后，該團隊首次在離體3D培育體系中，將腸道干細胞或隱窩，誘導形成含有潘氏細胞、杯狀細胞、腸內分泌細胞的空腔樣“迷你腸”，即腸道類器官。腸道類器官培育方法的開創(chuàng)性提出，不僅可用來研究腸道發(fā)育進程，而且為患者提供了個體化疾病模型或個體化腸道組織修復供體，可用于精準醫(yī)學和腸道疾病特異性藥物研究?，F(xiàn)將腸道類器官的培育、功能及其在腸疾病模型和藥物測試中的應用研究進展情況綜述如下。

1 腸道類器官的培育、功能

近些年，器官樣組織培育平臺得到快速發(fā)展，以模擬在體組織發(fā)育進程、構建疾病模型等，如肝、胰腺、腎臟、中樞神經系統(tǒng)及腸道類器官[4]。在過去十年中，體外培養(yǎng)和維持腸上皮細胞(IEC)的技術取得重大突破。同時LGR5+干細胞的特異性標記和腸道干細胞生態(tài)位的確定[3]，為3D腸道器官樣組織的培育奠定基礎，使得離體擴增腸上皮成為可能。2009年，Clevers團隊首次培養(yǎng)出了3D腸道類器官[5]。離體的腸道干細胞或隱窩在基質膠以及多種生長因子中培養(yǎng)可不斷增殖，并且能夠分化出潘氏細胞、杯狀細胞、腸內分泌細胞等各種成熟細胞，不僅自我組建形成具有多個隱窩的空腔樣結構，而且保留了腸道干細胞的自我更新及分化能力[5]。隨后，2015年，Wang等[6]利用成體干細胞體外培養(yǎng)和氣液界面三維分化技術，成功培養(yǎng)出可在體外長期保持良好自我更新狀態(tài)的干細胞，適用于所有柱狀上皮組織來源的成體干細胞的體外培養(yǎng)和分化，進行氣液界面培養(yǎng)分化后，可自發(fā)形成各種3D腸上皮組織，如胃、小腸、結直腸、肝管、胰腺導管等組織器官，該上皮組織具有完善的上皮屏障結構和功能。

1.1 腸道類器官的培育方法 大量研究[7]表明，在蛋白因子和細胞外基質支架供應充足的情況下，來源于小鼠、人或其他種屬的IEC(包括小腸、結腸和胎兒腸)，均可自我組建形成獨特的3D組織樣結構，而且干細胞擴增速度非?？?。目前，腸道類器官有兩種方法培育而得，即通過成體患者供體的腸道隱窩分離獲得，或者通過人胚胚胎干細胞(hESCs)或人誘導性多能干細胞(hiPSCs)離體分化而得。

無論是原代組織，還是干細胞來源的類器官，其培養(yǎng)條件基本相同，基礎培養(yǎng)基都包含DMEM/F12、N2、B27、煙酰胺、N-乙酰半胱氨酸。此外，還需要向基礎培養(yǎng)基中額外添加表皮生長因子(EGF)、頭蛋白(Noggin)、胃分泌素(gastrin)等生長因子，這對于調節(jié)腸黏膜生長和IEC的增殖是必需的。另外，Wnt3a的存在對于調節(jié)腸道干細胞自我更新、增殖和分化是至關重要的，因為腸隱窩干細胞中LGR5的表達依賴于經典的Wnt信號傳導途徑，且由R-Spondin-1和Noggin的BMP4抑制調節(jié)[8]。

成體腸組織來源培育腸道類器官，可在內窺鏡檢查或手術切除期間，從腸道活檢中分離獲得腸隱窩[9,10]。隱窩從上皮手動分離后，包埋到含有Wnt、R-Spondin、EGF、Noggin的MatrigelTM中，進而在包含所有添加因子和生長因子的組織培養(yǎng)基中生長。在接下來的7～10 d培養(yǎng)過程中，隱窩逐漸伸長并擴增，形成首個器官樣結構。成熟的腸樣或結腸樣組織，不僅包含LGR5+干細胞，還包含括腸細胞、腸內分泌細胞、杯狀細胞和潘氏細胞等稱成熟細胞。人干細胞來源的腸道類器官，通過hESCs或hiPSCs分化發(fā)育形成腸上皮獲得。hESCs或hiPSCs先后經歷終末內胚層、后腸內胚層、腸祖細胞的2D分化發(fā)育培養(yǎng)階段，之后轉移到MatrigelTM的3D培養(yǎng)平臺，細胞自發(fā)地重排形成腸道類器官。

1.2 腸道類器官的功能 腸道類器官的功能分析已在多種實驗中開展。由細胞簇自我組建形成的3D樣腸道類器官，可重現(xiàn)其在體原生組織的重要特征，包括與原生腸上皮相似的、由隱窩和絨毛組成的高度折疊的上皮結構[7]。細胞簇一旦嵌入到基質膠(MatrigelTM)中，開始自我組建，上皮的腔表面朝向類器官的中心，基底側與MatrigelTM和周圍的培養(yǎng)基接觸，逐漸形成腸道類器官。腸道類器官不僅包含在體原生腸組織中的幾乎全部細胞類型，而且表現(xiàn)出與在體相似的功能，如黏液產生、吸收和分泌功能[11]，可用于研究內穩(wěn)態(tài)和疾病狀態(tài)下不同細胞之間相互作用的復雜性。此外，腸道類器官還可模擬在體上皮再生能力，隨著凋亡細胞逐漸釋放到類器官腔中，隱窩內的LGR5+細胞分化形成新的細胞，以補充上皮細胞。

腸細胞的重要基礎功能是運輸水和電解質穿過腸屏障。實驗表明，離體狀態(tài)下，衍生形成的缺乏頂端轉運蛋白SGLT-1或PEPT1的腸道類器官，可抑制D-葡萄糖、D-果糖和肽類轉運透過上皮膜，證明其作為營養(yǎng)吸收和藥物轉運機制模型的潛在用途[12]。腸上皮的滲透性可影響小分子穿透腸屏障的擴散、阻止細菌通過血流移位。最近一項研究[13]證明，腸道類器官可模擬上皮的通透性。通過將熒光標記的葡聚糖注射入腸腔，同時使用自動顯微鏡，可實時捕獲并量化活細胞變化情況、腔表面的斷裂等。該技術可用于研究慢性炎癥條件下和細菌入侵期間的腸滲透性的改變。毛喉素誘導的腫脹實驗已在類器官中開展，證明囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子(CFTR)離子通道的功能[14]。

2 腸道類器官在腸疾病模型和藥物測試中的應用

腸道類器官于2009年首次提出，在近十年的發(fā)展中，該技術不僅逐漸應用于研究正常腸功能，還用來研究腸道功能障礙、腸道疾病以及藥物測試平臺構建。

2.1 腸道類器官在腸疾病模型中的應用

2.1.1 IBD IBD是一種病因不十分清楚、可影響整個胃腸道的慢性的進行性、復發(fā)性疾病，由胃腸道中對抗抗原的先天性和適應性免疫應答失調而引起。IBD分為潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。UC僅限于結腸，是結腸黏膜層和黏膜下層的連續(xù)性炎癥，先累及直腸，逐漸向全結腸蔓延；CD可影響消化道的任何區(qū)域，為非連續(xù)性全層炎癥，最長累及的部位為末端回腸、結腸和肛周[15]。在活動性IBD期間，小腸和大腸均可能高度發(fā)炎，導致上皮細胞破壞和消化能力下降。IBD患者來源的腸道類器官，可用于模擬IBD患者中先天性免疫系統(tǒng)的調節(jié)模式，以確定新型療法降低疾病嚴重性的可能性。

腸道類器官主要由上皮組成，包括腸干細胞自我更新的生態(tài)位，但是缺乏在體中維持腸整體結構和功能的間充質組織、免疫和神經細胞。在體外培養(yǎng)環(huán)境下，iPSCS分化獲得的誘導性腸道類器官，移植到小鼠腎囊內后，可產生間充質，進而分化形成平滑肌和成纖維細胞[11]。這一進程雖然能代表體內的腸結構，但是耗時較久，且缺乏最常見的腸道疾病IBD所必需的免疫細胞。為模擬免疫細胞和上皮細胞的相互作用，類器官可以與免疫細胞共培養(yǎng)，如分離的上皮內淋巴細胞，以研究炎癥性疾病的病理學。

2.1.2 短腸綜合征(SBS) SBS通常由于IBD、CRC或缺血性疾病導致的大腸部分切除而引起，有時在出生時就存在。SBS患者的腸上皮表面積顯著減少，伴有吸收障礙、腹瀉和營養(yǎng)不良等癥狀。先天性SBS患者，與CLMP基因的遺傳基礎有關。患者來源的小腸類器官，為更加深入地研究遺傳易感性提供了可能性，包括發(fā)育過程中腸道伸長受損的分子機制[16]。此外，腸道類器官與延長小腸的組織工程技術相結合，可在不考慮SBS病因的情況下，為恢復腸道正常功能提供了潛在的方法。

2.1.3 乳糜瀉 乳糜瀉是一種自身免疫疾病的例子，主要影響小腸對麥膠蛋白(麩質食物)的消化，進而由于吸收障礙引起炎癥，導致一系列其他連續(xù)性癥狀。若在飲食中不排除所有麩質食物，長時間的炎癥可能會導致骨質疏松癥、癌癥等。乳糜瀉患者來源的類器官，可用于深入研究遺傳素質和疾病驅動機制。乳糜瀉患者中腸屏障的完整性，也可通過類器官進行研究[17]。類似地，患者來源的類器官可用于構建藥物篩選平臺，以鑒定新型療法。

2.1.4 憩室病 憩室病是指腸上皮突出形成的囊狀結構，通常發(fā)生在乙狀結腸中，由腸道機械性損傷導致的功能喪失引起[7]。憩室引發(fā)的感染和發(fā)炎，可能導致患者出現(xiàn)發(fā)燒、疼痛、惡心和腹瀉。目前，憩室病的病因學尚不清晰，可能是由于低纖維飲食導致的大腸過度壓力引起，也可能是先天性遺傳因素引起。因此，通過相對無創(chuàng)地腸組織活檢，培育獲得患者組織來源的類器官，不僅可用于研究憩室病發(fā)病機理的遺傳因素，而且可通過與健康的腸組織進行比較，以確定遺傳素質和功能差異。由于憩室病疾病進程的力學性能，可對個體化類器官施加機械性壓力，模擬腸道上皮對不同水平下拉伸力的反應。但是，由于在體腸上皮周圍涉及間質和肌肉層，單獨的腸道類器官不適合模擬憩室疾病進程，因此需要組織工程方法與類器官技術相結合來模擬憩室病。

2.1.5 囊性纖維化(CF) CF是一種由CFTR突變引起的遺傳性疾病。雖然許多研究表明CF主要作用在肺部，但在腸中也可以觀察到液體和電解質穩(wěn)態(tài)的改變。研究表[18]明，CFTR突變小鼠和人類CF患者的直腸衍生培養(yǎng)物中可檢測到CFTR介導的表型。因此，利用患者來源的腸道類器官，結合毛喉素誘導的腫脹實驗和電壓門測量實驗，可精確地測量流體和離子運輸?shù)母淖僛14,18]；同時，適用于構建CF藥物篩選平臺，以確定CFTR增效劑和基因治療的個體藥物反應[7,14]。

2.1.6 結腸直腸癌(CRC) CRC是全世界第三最常見的疾病，具有較高的致死率。CRC疾病因素復雜，但是長期的CD或UC可顯著增加患CRC的風險。盡管越來越多的類器官被用作模擬CRC模型，但是目前的CRC模型不能再現(xiàn)早期疾病進展，也不能表征腫瘤的異質性。因此，類器官技術可與基因編輯技術相結合，將突變基因引入到目的基因中，例如利用CRISPR/Cas9編輯APC腫瘤抑制基因[19,20]；或將基因修飾的類器官移植到小鼠體內，測量腫瘤發(fā)育和侵襲的體內機制[21]。

2.1.7 食管腺癌 Barrett食管作為癌前病變，在數(shù)十年的再生生長過程中，可逐漸演變?yōu)槭彻芟侔?015年，Wa團隊首次在體外3D培養(yǎng)分化獲得Barrett食管干細胞，進而與同一病人來源的胃干細胞或食道干細胞相比，獲得其特異的基因表達譜[22]。而且Barrett食管干細胞能分化為腸化生組織的各種細胞類型，且移植到小鼠體內后，可形成類似于人食管腺癌測腫瘤。因此，以Barrett食管干細胞作為食道腺癌的靶點，可用于腫瘤預防和治療研究；以Barrett食管干細胞分化為腸化生組織，可模擬食管腺癌疾病進程。

2.1.8 放射性腸損傷 除以上疾病模型外，類器官模型還可用來研究腸道損傷，例如放射性腸炎。臨床前動物研究表明，輻射后損傷的小腸隱窩增殖再生與轉錄阻遏物MTG16、血管心外膜蛋白BVES、STAT5活化有關。因此，可利用輻射小鼠產生類器官以及直接輻射類器官，建立放射性腸炎模型，用于放射治療后的敏感位點、腸道活力、干細胞功能和修復研究。

2.1.9 細菌和病毒感染模型 腸道是人體抵御外界病原感染的關鍵屏障，通過腸道傳播的病毒，包括諾如病毒、輪狀病毒等，都是重要的致病原。但由于細菌或病毒的附著位點通常位于頂端表面，最常用的3D培養(yǎng)方法不能用于模擬細菌和病毒感染。為克服這一點，Wang等[6]利用成體干細胞體外培養(yǎng)和氣液界面3D分化技術，不僅在體外更好地模擬和構建了腸道上皮的3D結構，而且模擬了艱難梭菌感染腸道而導致的假膜性結腸炎。該模型的建立，有助于從病理組織學變化、基因表達、腸上皮屏障功能障礙等方面深入解析假膜性結腸炎的發(fā)生過程和致病機理，為開發(fā)新型藥物和治療方案提供重要的理論依據(jù)。也有研究表明，在Transwells中將腸狀結構培育2D單層細胞，破壞其3D結構但保留分化能力，允許極化并暴露頂端表面。這一模型，不僅可用于研究屏障功能、轉胞吞作用、細胞極化，也使得該模型易于感染、并檢測與感染相關的附著脫落損傷。

2.2 腸道類器官在藥物測試中的應用 人體腸黏膜是藥物吸收、分布、代謝、排泄和毒性的關鍵位點，但在體外難以重現(xiàn)。盡管腸道類器官可用于腸道研究，包括器官發(fā)育、疾病模型和再生醫(yī)學，但是缺乏在體解剖學和生理學特征。最明顯的特征是，朝向內皮方向的類器官閉合腔使頂端表面難以實現(xiàn)吸收、分布、代謝和排泄測定。最近一項研究顯示，通過使用離體細胞外基質或多細胞合成支架的去細胞化和再細胞化構建的3D支架，可顯著地增加發(fā)育和疾病模型的準確性；該方法具有諸多優(yōu)勢，不僅為細胞培養(yǎng)成管狀結構提供了基礎，使其具有更加精確的上皮樣圖案和一致的細胞數(shù)量，而且可根據(jù)研究的腸道區(qū)域或模擬的疾病模型，改變細胞組成，為局部區(qū)域的腸道提供了一定的解剖學特征。此外，在腸道組織離體培養(yǎng)中，引入生物打印技術，生成由人類原發(fā)性IEC和肌成纖維細胞組成的3D腸組織，可模擬在體原生腸的結構和功能。該3D腸組織，具有緊密連接和特化上皮細胞類型的極化上皮，表達功能性和誘導型CYP450酶，不僅發(fā)育形成生理屏障，區(qū)分高滲透性和低滲透性化合物，而且具有功能性P-gp和BCRP轉運蛋白。在生化和組織學方面，3D腸組織可以對化合物誘導毒性和炎癥損傷產生反應。這一方法的開創(chuàng)性提出，可與現(xiàn)有的臨床前測定相兼容，為增強藥物研發(fā)中的安全性和功效預測提供新的臨床試驗模型。

綜上所述，成體組織活檢或多能干細胞定向誘導分化產生的腸道類器官，表型穩(wěn)定，培養(yǎng)操作相對簡單，可用于原生腸道發(fā)育、個體化疾病模型、精準醫(yī)學和腸疾病特異性藥物測試等研究。盡管目前的類器官培養(yǎng)技術不允許組裝復雜的多細胞類器官，具有一定的局限性，但是腸道類器官相對于組織培養(yǎng)細胞系仍有許多優(yōu)勢。未來，腸道類器官與CRISPR/Cas9基因編輯、3D生物打印等新興技術結合，可構建更加復雜、更加精確的腸疾病研究平臺，在腸道疾病基因治療和移植應用中發(fā)揮更大的潛力，更好地用于疾病模擬、藥物發(fā)現(xiàn)和個性化醫(yī)療。我們相信，隨著類器官培育和技術的快速發(fā)展，腸道類器官在人類腸疾病研究和組織再生醫(yī)學中，將發(fā)揮不可估量的價值。