米向斌 賴寬 魏姍姍

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院皮膚科（廣州510280）；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科（廣州510515）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞[1]。MSC可產(chǎn)生大量生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫、激活內(nèi)源性干/祖細(xì)胞、促進(jìn)組織損傷修復(fù)、促進(jìn)血管新生、抗細(xì)胞凋亡以及歸巢等多方面的作用，被認(rèn)為是一種有前景的治療手段[2]。MSC在許多疾病治療中都表現(xiàn)出很好的療效，特別是血液病、自身免疫性疾病、組織損傷性疾病和退行性疾病，但確切機(jī)制尚不完全明確。自噬是細(xì)胞內(nèi)一種通過溶酶體降解長壽命蛋白和受損細(xì)胞器的代謝途徑，在細(xì)胞應(yīng)激過程中起到了重要作用。MSC是近年來廣為研究的新治療手段，在自噬調(diào)控過程中的作用機(jī)制仍在探索。本文就MSC對(duì)宿主細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制作一綜述，為其基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用提供參考。

1 MSC與細(xì)胞自噬

自噬是真核生物特有的溶酶體介導(dǎo)的分解代謝過程，分為巨自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬和微自噬3種[3]。目前巨自噬研究較清楚，mTOR通路、JNK/Bcl-2/Beclin 1通路、IP3和細(xì)胞內(nèi)Ca2+都可以調(diào)控巨自噬的活性[4]。巨自噬是一種具有高度選擇性的降解過程，其中熱休克蛋白70（HSP70）在其途徑中發(fā)揮著重要作用。微自噬是將胞質(zhì)直接吞入溶酶體，其分子機(jī)制與調(diào)控及對(duì)人類疾病的影響尚不完全清楚。Atg8家族蛋白是細(xì)胞自噬過程中重要的適配器蛋白，廣泛分布于自噬體的內(nèi)外膜上，參與了細(xì)胞自噬過程中的許多關(guān)鍵步驟，比如自噬體的形成、成熟、招募降解底物等[5]。Atg8（在哺乳動(dòng)物中的同系物是LC3蛋白）的羧基末端被蛋白酶Atg4B切割后形成胞質(zhì)蛋白LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ進(jìn)一步被磷脂酰乙醇胺脂化為LC3-Ⅱ，通常由LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值可以評(píng)價(jià)自噬的活化程度[6]。

在不同來源的MSC治療疾病的過程中，自噬都發(fā)揮著重要的作用。有學(xué)者[7-8]在用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC）移植治療燒傷引起的神經(jīng)性疼痛大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，ADSC能明顯緩解大鼠的疼痛，并且降低大鼠灰質(zhì)后角細(xì)胞中Beclin 1、LC3-Ⅱ的表達(dá)和自噬體數(shù)量。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）通過激活自噬而減輕INS-1細(xì)胞慢性高葡萄糖誘導(dǎo)的損傷和降低人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中缺血再灌注損傷（ischaemia/reperfusion-induced injury，IRI）的嚴(yán)重程度[9]。LI等[9]通過體內(nèi)研究驗(yàn)證了上述結(jié)論：BMSC可通過自噬促進(jìn)T2D大鼠胰腺損傷的恢復(fù)和降低C57BL/6J小鼠肺IRI的嚴(yán)重程度。臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，ucMSC）可作用于線粒體而調(diào)控T淋巴細(xì)胞自噬活性[10]。此外，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hucMSC）來源的外泌體（exosomes，Ex）通過自噬而減緩順鉑誘導(dǎo)的急性腎臟損害[11]。

目前越來越多的研究[12-13]表明，MSC治療關(guān)鍵點(diǎn)主要是旁分泌機(jī)制，而不是MSC本身。外泌體是起源細(xì)胞釋放的攜帶其特征表面抗原的小囊泡，是細(xì)胞間的旁分泌機(jī)制。外泌體可通過轉(zhuǎn)移RNA、蛋白質(zhì)和生物活性脂質(zhì)在細(xì)胞間作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且由于避免了干細(xì)胞移植可能導(dǎo)致的病理分化或腫瘤，外泌體在移植治療中可能比干細(xì)胞更有優(yōu)勢[13]。

2 MSC移植對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用

MSC可通過多條通路調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞自噬，主要包括mTOR通路、STAT3通路和HO-1通路。MSC亦可通過自噬調(diào)控Aβ和α-突觸核蛋白而對(duì)神經(jīng)退行性疾病起到治療作用。

2.1 mTOR通路mTOR是細(xì)胞內(nèi)一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞生長、新陳代謝、衰老的中心控制器，在自噬調(diào)節(jié)方面起著重要的作用[14]。mTOR通路可通過以下途徑調(diào)控巨自噬的活性：（1）在營養(yǎng)豐富的條件下，Ragultor作用于RHEB而激活mTORC1，mTORC1激活可抑制巨自噬激活；（2）低ATP/AMP比例可激活A(yù)MPK復(fù)合物，進(jìn)一步活化TSC1/TSC2而抑制RHEB，在這種情況下mTORC1被抑制而巨自噬啟動(dòng)；（3）下降的PI3KI/Akt可間接失活mTOR而啟動(dòng)巨自噬[15]。

JIANG等[16]在ADSC與大鼠軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)：ADSC可降低大鼠軟骨細(xì)胞mTOR、p-mTOR、p62的表達(dá)，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率和自噬體的數(shù)量而抑制其促炎因子的分解代謝。也就是說，ADSC可通過mTOR通路介導(dǎo)的自噬來調(diào)控軟骨細(xì)胞促炎因子水平。ZHOU等[17]用ADSC移植治療膝關(guān)節(jié)炎模型鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)：ADSC可降低炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α，上調(diào)LC3-Ⅱ，下調(diào)p62、Akt、p-Akt、p-CAMKⅡ、CAMKⅡ、p-Smad1、Smad1的表達(dá)。ADSC可能通過p-Akt/Akt、p-CAMKⅡ/CAMKⅡ、p-Smad1/Smad1信號(hào)通路調(diào)控自噬活性而抑制軟骨損傷和細(xì)胞凋亡。

MSC移植在肺臟、腦IRI中也有一定的療效。LI等[9]在MSC移植治療肺IRI的過程中發(fā)現(xiàn)：MSC移植可增加宿主細(xì)胞PI3K classⅢ的表達(dá)，上調(diào) LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率，降低p62、PI3K classⅠ、p-Akt的表達(dá)；PI3K classⅢ作用于Beclin 1增加自噬活性，而PI3K/Akt可負(fù)性調(diào)控自噬活性。也就是說，MSC移植可通過PI3K/Akt或PI3K classⅢ/Beclin 1調(diào)控自噬活性。在另一個(gè)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中，MSC可通過下調(diào)肺內(nèi)皮細(xì)胞中miR-142a-5p而調(diào)控Beclin 1介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，從而逆轉(zhuǎn)小鼠肺部損傷[18]。HE 等[19]研究發(fā)現(xiàn)MSC可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路而啟動(dòng)自噬，最終延緩腦IRI的進(jìn)展。

2.2 STAT3通路STAT3與細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞死亡密切相關(guān)，PKR與多種感染有關(guān)，STAT3抑制或缺乏可激活PKR而磷酸化eIF2α，此過程在感染性疾病中發(fā)揮著重要作用。一項(xiàng)關(guān)于原發(fā)性膽汁膽管炎的體外研究[20]發(fā)現(xiàn)，hucMSC可降低宿主細(xì)胞炎癥因子水平，增加自噬活性。人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞與hucMSC共培養(yǎng)后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率升高，p62、STAT3和p-STAT3表達(dá)下降；在沉默肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的STAT3后，無論是否與hucMSC共培養(yǎng)，兩組p-eIF2α、PKR均表達(dá)上升，提示hucMSC可通過STAT3/PKR/eIF2α通路而啟動(dòng)自噬。

2.3 HO-1HO-1是一種應(yīng)激誘導(dǎo)型酶，具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化的潛力，HO-1可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激預(yù)防肝IRI。WANG等[21]在BMSC移植治療肝IRI的研究中發(fā)現(xiàn)，BMSC可通過HO-1增強(qiáng)自噬活性而對(duì)肝臟IRI起到保護(hù)的作用。研究中用3-甲基腺嘌呤抑制自噬、鋅原卟啉IX抑制HO-1，3-甲基腺嘌呤和鋅原卟啉IX兩者均可阻斷BMSC對(duì)自噬的作用。BMSC可通過HO-1介導(dǎo)的自噬來保護(hù)肝臟免受IRI。

2.4 α-突觸核蛋白α-突觸核蛋白是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前及核周表達(dá)的可溶性蛋白質(zhì)，是路易小體的主要成分，與帕金森病的發(fā)病機(jī)制和相關(guān)功能障礙密切相關(guān)。α-突觸核蛋白異常積累是由于tau磷酸化誘導(dǎo)的軸突運(yùn)輸缺陷引起的，是造成黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞損失的主要原因。OH等[22]研究發(fā)現(xiàn)MSC可通過調(diào)控自噬相關(guān)的tau磷酸化，緩解微管依賴性軸突運(yùn)輸障礙來減少α-突觸核蛋白的積累，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用?？偠灾?，MSC可能通過增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞自噬的活性來減少其α-突觸核蛋白的累積，最終神經(jīng)元細(xì)胞存活增加，帕金森病情好轉(zhuǎn)。

2.5 β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）Aβ是由36～43個(gè)氨基酸組成的多肽，由BACE1/β-分泌酶和γ-分泌酶對(duì)淀粉樣蛋白前體蛋白連續(xù)蛋白水解而成，Aβ積聚是阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）發(fā)病的基礎(chǔ)。XU等[23]用小膠質(zhì)細(xì)胞與ucMSC共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞中LC3Ⅱ、Beclin-1、Aβ降解酶IDE和Nep的表達(dá)升高，Aβ25-35減少，細(xì)胞凋亡減少，結(jié)果表明ucMSC可通過調(diào)控自噬來保護(hù)小膠質(zhì)細(xì)胞免受Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞損害。綜上可知，MSC移植可增強(qiáng)AD模型中自噬活性和Aβ的清除，最終神經(jīng)元細(xì)胞存活增加，疾病本身得到緩解。

3 MSC來源的外泌體對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用

MSC來源的外泌體可通過mTOR通路、p53-Bnip3通路調(diào)控宿主細(xì)胞自噬，從而對(duì)疾病起到治療作用。但是由于目前的研究有限，外泌體與MSC移植的作用機(jī)制或療效的差異仍是一個(gè)謎團(tuán)，有待進(jìn)一步的研究。

3.1 mTOR通路WANG等[11]在大鼠腎上皮細(xì)胞與hucMSC-Ex共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Ex可增加NRK-52E中腎上皮細(xì)胞的表達(dá)，并上調(diào)自噬相關(guān)基因atg5、atg7。此外，體內(nèi)研究顯示：hucMSC-Ex移植對(duì)腎毒性大鼠模型有治療作用，可下調(diào)腎臟組織中mTOR、p-mTOR及其下游p70S6K和4EBP1蛋白的表達(dá)[11]和炎癥因子TNF-α，促進(jìn)IL-1β、NF-κB-P65的分泌。由此可以推測hucMSC-Ex可通過mTORC1通路介導(dǎo)的自噬來緩解大鼠腎臟損害。EBRAHIM等[24]用MSC-Ex治療糖尿病腎病大鼠：相對(duì)于正常對(duì)照組，糖尿病腎病大鼠的mTOR通路被激活，而自噬被抑制；MSC-Ex移植治療后可降低mTOR、S6K1和p62的表達(dá)，升高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率，同時(shí)降低炎癥因子TGF-β，說明MSC-Ex可通過mTOR通路調(diào)控自噬而治療糖尿病腎病。此外，LIU等[25]用MSC-Ex移植治療心肌IRI模型鼠中發(fā)現(xiàn)，MSC-Ex可通過AMPK/mTOR、Akt/mTOR通路調(diào)控心肌細(xì)胞自噬來治療心肌IRI。

3.2 p53-Bnip3p53基因是一種典型的腫瘤抑制基因，能調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，Bnip3是Bcl2/腺病毒E1B-19 kDa蛋白相互作用蛋白3，這兩個(gè)都是已知的自噬激活劑。p53、Bnip3在小鼠心肌梗死模型中表達(dá)升高，MSC-Ex與分離的心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后可降低心肌細(xì)胞p53、Bnip3的表達(dá)以及自噬泡、自噬溶酶體數(shù)量，說明MSC-Ex可通過p53-Bnip3而調(diào)控自噬活性[26]。XIAO等[26]研究發(fā)現(xiàn)MSC-Ex中富含miR-125b-5p，而miR-125b-5p的靶基因是p53。在缺氧和血清剝奪培養(yǎng)的新生小鼠心肌細(xì)胞中，自噬通量、細(xì)胞死亡和p53-Bnip3信號(hào)通路活性增加；當(dāng)細(xì)胞與MSC或MSC-Ex共培養(yǎng)時(shí)，信號(hào)通路活性和自噬相關(guān)指標(biāo)下降，但是當(dāng)外泌體抑制劑（GW4869）作用于心肌細(xì)胞時(shí)，這些改變會(huì)消除，也就是說MSC是通過旁分泌機(jī)制（外泌體）介導(dǎo)的p53-Bnip3通路調(diào)控心肌細(xì)胞自噬。在隨后的MSC-Ex移植治療心肌梗死模型鼠中，得到了與體外實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果，也就是說MSC-Ex可通過自身攜帶的miR-125b-5p作用于p53-Bnip3通路而調(diào)控心肌細(xì)胞自噬。

4 MSC研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

MSC移植已廣泛應(yīng)用治療白血病等血液系統(tǒng)疾病，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫疾病中也得到了不錯(cuò)的療效[27]。MSC移植已用于治療心肌梗死、難治性糖尿病、肢體缺血性疾病患者的臨床試驗(yàn)并得到了好的療效，在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)、肺部損傷等方面的研究暫時(shí)仍在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，未應(yīng)用在臨床。

MSC是治療心臟疾病最有潛力的手段，移植后可歸巢到損傷的心肌部位，并根據(jù)微環(huán)境的不同分化表達(dá)肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白或肌鈣蛋白等；亦可分泌細(xì)胞因子，如心血管生長因子，發(fā)揮修復(fù)損傷心肌的作用。STRAUER等[28]用MSC移植治療慢性心肌梗死患者，結(jié)果顯示患者心肌梗死面積減少30%，左心室射血分?jǐn)?shù)增加15%，而對(duì)照組未見明顯變化。MSC移植對(duì)難治性糖尿病或合并嚴(yán)重并發(fā)癥的患者也有好的療效[29]，其作用機(jī)制可能為：（1）MSC分泌多種細(xì)胞和生長因子；（2）MSC直接或促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)的胰腺干細(xì)胞分化為B細(xì)胞。BHANSALI等[30]的一項(xiàng)隨機(jī)雙盲的臨床研究選取20例難治性2型糖尿病患者，隨機(jī)接受MSC和安慰劑，結(jié)果顯示MSC移植組胰島素用量顯著下降，且胰島素C肽水平顯著提高。此外，MSC移植可誘導(dǎo)缺血區(qū)血管的發(fā)生、增加毛細(xì)血管的密度和血流量。AMANN等[31]用BMSC移植治療嚴(yán)重肢體缺血患者，納入標(biāo)準(zhǔn)為最大保守治療失敗需要截肢者，移植后6個(gè)月時(shí)可使59%患者免于截肢，但此方法仍處于臨床試驗(yàn)階段，需要更多的臨床試驗(yàn)才能獲得推廣。

5 展望

MSC移植作為一種頗有前景的治療手段，迄今為止，已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)開展了881項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)研究。然而令人遺憾的是，其具體的作用機(jī)制尚不完全明確。自噬是真核細(xì)胞中重要的物質(zhì)降解過程，在MSC治療過程中也發(fā)揮著重要的作用。目前對(duì)于MSC移植過程中自噬的調(diào)控機(jī)制正在被逐漸認(rèn)識(shí)和解析，但具體的分子機(jī)制仍不是十分清楚，進(jìn)一步研究自噬及其相互作用，將有助于深入了解MSC的治療機(jī)制，也為其應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。