趙芮 王亮

1南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院（廣州 510282）；2南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院血液內(nèi)科（廣州 510282）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是髓系造血干/祖細胞惡性疾病，是成人白血病最常見的形式。過去30年來AML治療僅有輕微改變，預(yù)后仍然較差[1]。因AML的高度異質(zhì)性，臨床已采用針對特定基因突變的分子靶向藥物與化療藥物聯(lián)合的治療方案：如FMS樣酪氨酸激酶3（fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3）、BCL2抑制劑、異檸檬酸脫 氫 酶 1/2（isocitrate dehydrogenase1/2，IDH1/2）抑制劑、NMD2抑制劑等分子靶向藥物聯(lián)合化療藥物治療AML，表明了靶向治療的可行性與有效性[2-4]。臨床仍需新型且具有成本效益的前期治療以誘導(dǎo)AML緩解及預(yù)防其復(fù)發(fā)，還需適用于患者復(fù)發(fā)和等待移植期間的橋接療法以改善其預(yù)后。

T細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫是通過CD4+和CD8+T細胞的T細胞受體與抗原遞呈細胞提呈的肽-主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）配體結(jié)合從而激活多種信號傳導(dǎo)途徑和轉(zhuǎn)錄因子，使T細胞增殖并發(fā)揮殺傷腫瘤細胞功能[5]。但隨著參與抗原遞呈的MHC類基因表達下調(diào)，可導(dǎo)致免疫逃逸致使AML進展或復(fù)發(fā)[6]。嵌合抗原受體修飾的T細胞（chimeric antigen receptor engineered T cell，CAR-T）治療是將一種或多種特異性CAR表達于患者的T細胞使其可靶向消滅腫瘤細胞的過繼免疫療法。植入CARs的T細胞可進行非MHC依賴性抗原識別，從而有效地繞過腫瘤的主要免疫逃逸機制，如蛋白酶體抗原加工和MHC分子的下調(diào)等，從而特異性殺傷腫瘤細胞[7]。

目前CAR-T在治療多發(fā)性骨髓瘤、外周T細胞淋巴瘤、AML的臨床前評估中被證實有效，臨床常用的CD19 CAR-T細胞在治療急性B淋巴細胞性白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）及B細胞惡性淋巴瘤的臨床試驗中也已取得較滿意的療效，從而激起研究者將CAR-T治療應(yīng)用于更多血液腫瘤臨床試驗的興趣[8-10]。本文重點介紹近5年內(nèi)CAR-T治療AML的臨床研究進展。

1 CAR的結(jié)構(gòu)

典型CAR受體包括胞外區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域。胞外區(qū)由信號肽、抗原識別區(qū)及鉸鏈區(qū)組成。目前常用跨膜結(jié)構(gòu)域通常來源于Ⅰ型膜結(jié)合蛋白，如 CD4、CD8、CD28、CD3ζ或 FcεRIγ等。胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域含有第二活化信號，目前常用的結(jié)構(gòu)域包括具有刺激CD8+中央記憶型T細胞生長、增強糖酵解代謝作用的CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）、ICOS和CD27等[11]。根據(jù)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的不同可將CAR分為4代：一代CARs由單鏈抗體（single-chain antibodies，scFv）與包含3個免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-Based activation motif，ITAM）的CD3ζ連接構(gòu)成[12]；為了提高信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的強度，二代CARs的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含一個共刺激因子；三代CARs的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域則包含兩個共刺激因子；最新的四代CAR-T細胞（T cells redirected for universal cytokine killing，TRUCKs）在二代CARs的基礎(chǔ)上增加了可激活T細胞表達轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物如IL-12等細胞因子的核因子以增強T細胞活化，調(diào)節(jié)腫瘤血管和免疫微環(huán)境，但TRUCKs目前仍處于測試階段，臨床試驗記錄不足[13]。由于CAR細胞的結(jié)構(gòu)特點，CAR-T細胞可介導(dǎo)細胞毒性T細胞（cytotoxic T-lymphocytes，CTLs）特異性殺傷腫瘤細胞。

2 CAR-T細胞的采集及制備

對于大多數(shù)患者來說，從外周靜脈血分離單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）為CAR-T細胞制備收集足夠數(shù)量的CD3+細胞（＞ 0.6× 109）是安全可行的[14]。為提高CAR-T細胞濃度，在PBMCs分離過程中可加入磁性顆粒聯(lián)合單克隆抗體靶向選擇CD4+和CD8+細胞，減少外周血單核細胞和粒細胞含量；或采用流式細胞術(shù)分選出AML原幼細胞從而提高富集PBMCs濃縮物的T細胞產(chǎn)量[15-16]。待得到足夠數(shù)量的T細胞后，可在體外應(yīng)用慢病毒、SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)或電穿孔將編碼CAR的DNA或mRNA轉(zhuǎn)染入T細胞內(nèi)從而獲得細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（cytokine-induced killer cells，CIK）[17]。待得到足量CAR-T細胞后，可將其分一次或多次回輸至患者體內(nèi)，CAR-T細胞的效能并不隨其劑量增加而遞增，回輸入患者體內(nèi)的CAR-T細胞數(shù)量可參考美國重組DNA咨詢委員會的推薦劑量[18]，通?？稍贑AR-T回輸前1～3 d應(yīng)用環(huán)磷酰胺和氟達拉濱進行預(yù)處理以消耗體內(nèi)其淋巴細胞，提高CAR-T的有效性和持久性，并減少其毒性反應(yīng)[19]?；剌敽罂赏ㄟ^定量聚合酶鏈式反應(yīng)檢測骨髓或外周血中細胞復(fù)制數(shù)、單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)（single-photon emission computed tomography，SPECT）以檢測體內(nèi)In111標記的CAR-T細胞等方法評估其體內(nèi)運輸和持久性[20]。

3 CAR-T細胞在AML的臨床應(yīng)用

目前針對B-ALL的CAR-T細胞治療臨床上應(yīng)用最廣泛的靶點為CD19，在CAR-CD19 T細胞治療難治復(fù)發(fā)性B-ALL的隨訪中，83%的患者可達到完全緩解，受試患者的中位總生存期可達12.9個月（8.7～23.4個月）[21]。因CAR-T細胞在治療B-ALL中已證實其有效性、安全性，因此CAR-T細胞也被用于治療AML的臨床研究中。

因AML起源于白血病干細胞（leukemia stem cells，LSCs），因此消除LSC細胞是治療AML的重要目標[22]。LSCs表面表達與正常骨髓造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSC）相 似 的 抗 原 如CD34++CD38--，除此之外LSCs表面還表達CD33、CD123、CD44、CD13、CLL-1、CD96、TIM3、CD47、CD32和CD25等抗原，并不是每一個LSC細胞均可同時表達上述所有抗原，且某些抗原也表達于正常HSC表面[23]。EHNINGER等[24]通過流式細胞術(shù)檢測了319例AML患者LSC表面抗原，發(fā)現(xiàn)87.8%的AML表達CD33，9.4%的AML患者表達CD123而沒有表達CD33，69.5%的患者中觀察到同時存在兩種抗原。

3.1 CD33CD33主要表達于骨髓多能前體細胞、單能集落形成細胞、Kupfer細胞和肝細胞等細胞表面，且87.8%的AML患者骨髓細胞表面表達CD33[24]。臨床上已證實由靶向CD33的單克隆抗體與calicheamicin組成的吉妥珠單抗-奧唑米星（gemtuzumab ozogamicin，GO）可改善AML患者生存率，且對于誘導(dǎo)化療失敗的患者而言，含GO的化療方案的有效率達50%，因此CD33可作為治療AML的有效靶點之一[25]。體外的臨床前研究已證實了CD33 CAR-T細胞治療AML的可行性，因此CD33 CAR-T細胞也被應(yīng)用于治療AML的臨床研究中[26]。WANG等[27]臨床試驗表明 CD33 CAR-T細胞治療AML的持久有效性及安全性仍需進一步提高以應(yīng)用于治療AML的臨床試驗。

3.2 路易斯抗原（Lewis Y antigen，LeY）LeY是核心由四個己糖單元組成識別元件的胚胎抗原，在AML患者骨髓中表達率達46%且在正常組織中很少表達，因此LeY抗原可作為CAR-T細胞治療的靶點[28]。有研究者等[20]將純度為14%～38%的總計5×108～1.3×109結(jié)構(gòu)為LeY-scFv-CD28-CD3ζ的CAR-抗LeY T細胞回輸至4位試驗前已接受氟達拉濱和阿糖胞苷治療的難治復(fù)發(fā)AML患者體內(nèi)。接受CAR-T細胞輸注患者患者在治療期間均未發(fā)生3～4級細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），但CAR-T細胞回輸48 h后部分病例血清中IFN-γ和IL-2升高后下降，甚至出現(xiàn)病理組織學顯示有CD8+和AML原始細胞浸潤的皮疹（CD4+CD8+）、發(fā)燒及寒戰(zhàn)反應(yīng)。患者雖復(fù)發(fā)但骨髓LeY抗體表達并未下降，因此推測AML復(fù)發(fā)與CAR-T細胞轉(zhuǎn)基因表達下調(diào)或患者產(chǎn)生免疫抑制環(huán)境有關(guān)。

3.3 NKG2DNKG2D是一種在NK細胞和活化的CD8+細胞表面表達的激活性受體，其識別配體為MICA/B和UL-16結(jié)合蛋白家族（ULBP1-6）。HILPERT等[29]證實MICA/B或ULBP1-3存在于74%AML患者的骨髓原始細胞上，且試驗表明采集和生產(chǎn)自體NKG2D CAR-T細胞的可行性，因此臨床開始進行NKG2DL CAR-T細胞治療AML的嘗試[30]。

SALLMAN 等[31]和 BAUMEISTER 等[32]的臨床試驗結(jié)果證明了NKG2DL CAR-T細胞治療AML安全有效，無CRS、神經(jīng)毒性及脫靶效應(yīng)等毒性作用發(fā)生。但BARAGA?O等[33]研究表明隨著AML患者病情進展，NKG2DL可能被DNA甲基化導(dǎo)致表達沉默致使免疫逃逸。因此未來仍需更多臨床試驗去驗證NKG2DL是否可作為合適的CAR-T細胞治療靶點。

3.4 C型凝集素樣分子-1（c-typelectin-like molecule-1，CLL-1） CLL-1是Ⅱ型跨膜糖蛋白抑制性受體，92%的AML樣本CLL為陽性同時CLL-1不在HSC上表達，僅在粒細胞和前體單核細胞表面高表達，且CLL-1和CD33共同表達于95%AML樣品表面，因此CLL-1和CD33可聯(lián)合作為治療AML的靶點[34]。在臨床前試驗中，CLL-1 CAR-T細胞可殺傷AML細胞同時對HSC細胞無毒性作用，證實了CLL-1作為治療AML靶點的可行性與安全性[35]。LIU[36]在第60屆ASH年會上口頭報道了1例CLL1-CD33 cCAR-T細胞治療AML的一期臨床試驗結(jié)果，該患者為6歲兒童，曾患有范可尼貧血并最終進展為FLT3-ITD基因突變的AML，該患者接受氟達拉濱和環(huán)磷酰胺的預(yù)處理方案后連續(xù)2 d輸注1×106/（kg·d）CLL1-CD33 cCAR-T細胞。輸注12 d后該患者骨髓原始細胞比例由81%升至98%，但于第19天，該患者骨髓原始細胞消失并達到微小殘留病變完全緩解。該報道證明了CLL1-CD33 cCAR-T的安全性及有效性，為進一步開展CAR-T細胞治療AML的臨床試驗提供了理論依據(jù)。

細胞及動物臨床前實驗中也證實了CD123[37]、Wilms Tumor 1[38]、CD44v6[39]、folate receptor beta[40]、CD117[41]、CD38[42]、FLT3[43]及 PR1[44]可作為治療AML的靶點，未來有望在臨床試驗中開展嵌合上述靶點的CAR-T細胞治療AML的臨床試驗以獲得更有效的治療方案。

4 結(jié)語

綜上，在治療AML的臨床試驗中已證實CAR-T細胞具有體內(nèi)擴增快、持續(xù)時間長等優(yōu)勢。CAR-T細胞已成為治療B-ALL及B細胞惡性淋巴瘤的主要方法之一，但在治療AML的臨床應(yīng)用中仍存在效能不足、特異性低等問題。截止目前clinicaltrials.gov所登記的CAR-T細胞治療AML臨床試驗共有21項且已含有UCAR-T 123細胞。CAR-T細胞治療AML的臨床試驗樣本量仍較少，療效仍不確切，目前需要開發(fā)治療AML的有效靶點及更多的臨床試驗來提高CAR-T細胞對AML殺傷活性及特異性，相信未來克服了細胞毒性作用及提高療效的CAR-T細胞有望成為誘導(dǎo)AML緩解、預(yù)防AML復(fù)發(fā)并可用于復(fù)發(fā)型AML患者等待移植期間的有效橋接方法。