周祺祺，孫倩，王先火，張會來

(1 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中美淋巴瘤診治中心，天津300060；2 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院生物技術(shù)研究室/天津市腫瘤免疫與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

嵌合抗原受體T(CAR-T)細(xì)胞移植療法是當(dāng)下腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)之一。自2012年起，CAR-T細(xì)胞移植療法先后在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、B細(xì)胞淋巴瘤包括濾泡性淋巴瘤(FL)和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)的治療中取得前所未有的成功，隨后被美國FDA批準(zhǔn)為B細(xì)胞ALL和復(fù)發(fā)難治性大B細(xì)胞淋巴瘤的三線治療。目前全球有超過100項(xiàng)針對不同靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞的臨床實(shí)驗(yàn)[1]正在進(jìn)行。盡管CAR-T細(xì)胞移植療法能使眾多復(fù)發(fā)難治性腫瘤患者再次獲得緩解，但仍有30%～50%的腫瘤患者在接受CAR-T細(xì)胞移植療法治療后1年內(nèi)出現(xiàn)疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)[2,3]，有10%～20%的患者在接受CAR-T細(xì)胞移植療法治療后未得到緩解[2～4]。這些研究結(jié)果提示，應(yīng)用CAR-T細(xì)胞移植療法治療腫瘤仍然存在諸多挑戰(zhàn)，其中CAR-T細(xì)胞的成功制備、成功移植都會影響其治療效果，而CAR-T細(xì)胞的成功制備、成功移植受許多因素的影響?，F(xiàn)將CAR-T細(xì)胞制備及臨床應(yīng)用的影響因素研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 CAR-T細(xì)胞制備的影響因素

CAR-T細(xì)胞制備的影響因素眾多，其中患者T細(xì)胞采集數(shù)、患者T細(xì)胞質(zhì)量、CAR-T細(xì)胞的體外擴(kuò)增、CD4+/CD8+T細(xì)胞、起始T細(xì)胞表型、嵌合抗原受體(CAR)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建等影響因素的研究較受關(guān)注。

1.1 患者T細(xì)胞采集數(shù) 考慮到惡性腫瘤的高侵襲性，成功制備和及時(shí)回輸CAR-T細(xì)胞是確保該療法有效實(shí)施的重要決定因素。CAR-T細(xì)胞制備的首要步驟就是采集患者的T細(xì)胞。由于多數(shù)患者曾接受具有細(xì)胞毒性反應(yīng)的治療，常常導(dǎo)致患者達(dá)不到CAR-T細(xì)胞移植療法治療前所要求的T細(xì)胞數(shù)，而不得不放棄該治療。而一些患者即使能夠采集足夠數(shù)量的T細(xì)胞，如果沒有成功制備出相應(yīng)CAR-T細(xì)胞，也無法接受治療。在一項(xiàng)針對CD19 CAR-T細(xì)胞移植療法治療的Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)中[4]，兒童的篩選標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定中位基線絕對淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(ALCs)為1 288/μL(168～4 488/μL)，該標(biāo)準(zhǔn)表明目前CAR-T細(xì)胞移植療法治療相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)傾向于選擇ALCs處于正常生理范圍的患者，以此篩除T細(xì)胞采集數(shù)不足的患者。而在另一項(xiàng)CAR-T細(xì)胞相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)[5]中，入組患者的中位CD3+細(xì)胞計(jì)數(shù)為567/μL(145～2 144/μL)，中位ALCs為775/μL(230～4 620/μL)。因此，采集足夠數(shù)量的T細(xì)胞是接受CAR-T細(xì)胞移植療法治療的重要因素之一，而統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的篩選條件還需要參考更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)來明確。

1.2 患者T細(xì)胞質(zhì)量 采集的T細(xì)胞質(zhì)量也會影響CAR-T細(xì)胞的制備。報(bào)道[6]顯示，采用接受過化療(如含氯法拉濱、多柔比星的方案)的患者T細(xì)胞制備出的CAR-T細(xì)胞數(shù)量較少或質(zhì)量較差。此外，在曾接受環(huán)磷酰胺和阿糖胞苷治療的患者中觀察到，T細(xì)胞亞群出現(xiàn)選擇性減少[7]。所以盡量在患者接受化療前采集足量健康的T細(xì)胞來制備CAR-T細(xì)胞，可以提升其質(zhì)量。為解決上述問題，研究者們試圖利用健康供體的T細(xì)胞作為替代來制備通用型CAR-T細(xì)胞，目前采用異體干細(xì)胞[8]制備CAR-T細(xì)胞的臨床前研究[9]以及針對移植后復(fù)發(fā)腫瘤患者的臨床實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。研究[8]顯示，采用異體干細(xì)胞制備CAR-T細(xì)胞的患者出現(xiàn)高級移植物抗宿主病(GVHD)的概率很低，證明了這種方法的可行性。第三方供體制備CAR-T細(xì)胞技術(shù)能夠促進(jìn)通用型CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的開發(fā)，從而使更多患者能夠從中獲益[10]。雖然制備這類細(xì)胞產(chǎn)品需要額外修飾基因來避免CAR-T細(xì)胞的排斥反應(yīng)和GVHD的發(fā)生，但同時(shí)提供了克服CAR-T細(xì)胞移植療法治療耐藥性機(jī)制的契機(jī)。

1.3 CAR-T細(xì)胞的體外擴(kuò)增 CAR-T細(xì)胞需在體外進(jìn)行擴(kuò)增，以達(dá)到治療所需細(xì)胞數(shù)量。目前有兩種擴(kuò)增方案用于制備FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品[11,12]。一種是將CD3單克隆抗體加入培養(yǎng)液來刺激CAR-T細(xì)胞活化增殖；另一種是采用CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠直接對CAR-T細(xì)胞進(jìn)行分離富集后，通過磁珠上的抗CD3和抗CD28抗體介導(dǎo)CAR-T細(xì)胞活化增殖。研究[13]發(fā)現(xiàn)，加入細(xì)胞因子(如IL-2、IL-7、IL-15)能夠促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的體外擴(kuò)增過程，而不同的細(xì)胞因子可能導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞質(zhì)量不同進(jìn)而影響療效，但目前尚未知何種細(xì)胞因子更具備優(yōu)越性。

1.4 CD4+/CD8+T細(xì)胞 幾乎所有CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品都是由CD4+和CD8+T細(xì)胞共同產(chǎn)生，這兩種細(xì)胞亞群可能都發(fā)揮著治療作用。不同患者的CD4+/CD8+T細(xì)胞存在較大差異，這也可能影響CAR-T細(xì)胞的療效。一些臨床前研究[4,14]將CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分別單獨(dú)制備的CAR-T細(xì)胞以固定的比例回輸給患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的療效提高。但目前有關(guān)不同CD4+/CD8+T細(xì)胞的CAR-T細(xì)胞療效差異的研究尚未見報(bào)道。

1.5 起始T細(xì)胞表型 起始T細(xì)胞表型也是決定CAR-T細(xì)胞臨床療效的重要因素之一。在一項(xiàng)CD19 CAR-T治療CLL患者的臨床實(shí)驗(yàn)[15]中，研究者在治療有效的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了富含表達(dá)記憶相關(guān)基因的CAR-T細(xì)胞群，他們相較無應(yīng)答者具有數(shù)量更多的高表達(dá)IL-6受體的CD27+PD-1-CD8+CAR-T細(xì)胞。因此篩選具有特定表型的起始T細(xì)胞有可能提高CAR-T細(xì)胞制備成功率和療效[16]。

1.6 CAR結(jié)構(gòu)的構(gòu)建 構(gòu)建CAR結(jié)構(gòu)的方法不同也會影響CAR-T細(xì)胞特性，如擴(kuò)增動力學(xué)、持續(xù)時(shí)間以及后續(xù)療效。目前大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)采用的是第二代CAR-T細(xì)胞，它在第一代CAR-T細(xì)胞CD3ζ鏈的基礎(chǔ)上增加了單一共刺激結(jié)構(gòu)域CD28或4-1BB[17]。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體構(gòu)建出的不同CAR結(jié)構(gòu)會影響其基因轉(zhuǎn)染效率進(jìn)而影響CAR-T細(xì)胞的活性。在FDA已批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品以及大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)中均采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將CAR基因片段插入T細(xì)胞基因組中來構(gòu)建CAR結(jié)構(gòu)。目前在一些臨床實(shí)驗(yàn)[18]中，采用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了不依賴載體將CAR基因插入T細(xì)胞基因組并得到有活性的CAR-T細(xì)胞，證明了該方法的安全性和可行性[19]。

2 CAR-T細(xì)胞臨床應(yīng)用的影響因素

許多因素對CAR-T細(xì)胞的臨床應(yīng)用產(chǎn)生影響，其中對CAR-T細(xì)胞移植、CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)活化和擴(kuò)增、CAR-T細(xì)胞治療適應(yīng)人群、腫瘤細(xì)胞抗原丟失或缺失、細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)等的研究較多。

2.1 CAR-T細(xì)胞移植 如果在患者發(fā)生疾病進(jìn)展或嚴(yán)重并發(fā)癥之前未能及時(shí)移植CAR-T細(xì)胞，會影響治療的成功率。一項(xiàng)CD19 CAR-T細(xì)胞相關(guān)臨床研究[3]中，92例患者采集了T細(xì)胞，有17例患者最終沒有接受CAR-T細(xì)胞移植，有7例患者在CAR-T細(xì)胞移植前死亡，部分患者在治療中出現(xiàn)不良事件(真菌疾病或GVHD)導(dǎo)致患者終止移植CAR-T細(xì)胞。在另一項(xiàng)研究[2]中，共有78例患者采集了T細(xì)胞，在67例進(jìn)行CAR-T細(xì)胞制備的患者中有13例沒有接受移植，原因包括部分CAR-T細(xì)胞制備失敗以及部分患者病情加重而失去治療機(jī)會。因此，縮短CAR-T細(xì)胞移植延遲就能使部分患者在發(fā)生疾病進(jìn)展或嚴(yán)重并發(fā)癥之前接受CAR-T細(xì)胞移植療法治療，從而增加CAR-T細(xì)胞移植療法獲益的人數(shù)。未來CAR-T細(xì)胞療法的商業(yè)化以及更簡化的制備方法有望降低因CAR-T細(xì)胞移植時(shí)間延遲、錯(cuò)失治療時(shí)機(jī)導(dǎo)致治療失敗的概率。

2.2 CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)活化和擴(kuò)增 臨床研究[2～4]報(bào)道，CAR-T細(xì)胞移植療法治療所需的有效劑量非常小，目前的方案為患者每千克體質(zhì)量輸注(0.2～5.0)×106個(gè)CAR-T細(xì)胞或每次輸注(0.1～2.5)×108個(gè)CAR-T細(xì)胞，因此回輸后的體內(nèi)細(xì)胞活化和指數(shù)擴(kuò)增是至關(guān)重要的。其中，CAR-T細(xì)胞質(zhì)量、初始T細(xì)胞表型、細(xì)胞因子等在CAR-T細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增中起著重要作用，疾病負(fù)荷及[4]淋巴細(xì)胞清除率對CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)增也起到關(guān)鍵作用。臨床通常采用氟達(dá)拉濱為主的藥物清除淋巴細(xì)胞[14]來促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)增，然而氟達(dá)拉濱卻可能引發(fā)CAR-T細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性[20]，能否不依賴細(xì)胞毒性化學(xué)療法來實(shí)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增仍有待研究。

2.3 CAR-T細(xì)胞移植療法治療適應(yīng)人群 盡管CD19 CAR-T細(xì)胞治療療效較高，但能夠接受這種療法的患者十分有限。獲取CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的治療授權(quán)，要求機(jī)構(gòu)必須具備遵守產(chǎn)品生產(chǎn)和管理規(guī)程并安全管理患者的能力，中國缺乏CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品授權(quán)的癌癥中心，大量患者沒有機(jī)會接受相關(guān)治療。此外，高昂的費(fèi)用也嚴(yán)重阻礙了患者接受CAR-T細(xì)胞移植療法治療[21]。未來優(yōu)化制備方法、降低成本將有助于解決費(fèi)用和保險(xiǎn)覆蓋范圍方面的問題，使更多的患者不再由于經(jīng)濟(jì)問題而無緣接受CAR-T細(xì)胞移植療法治療。雖然CAR-T細(xì)胞在治療血液系統(tǒng)腫瘤時(shí)取得了較好的成績，但在治療實(shí)體瘤時(shí)還面臨諸多挑戰(zhàn)，例如實(shí)體瘤特異性靶點(diǎn)選擇困難、腫瘤微環(huán)境等因素，會抑制CAR-T細(xì)胞的活化擴(kuò)增、效能以及致死等嚴(yán)重不良反應(yīng)[22]等，這些因素導(dǎo)致實(shí)體瘤患者群體目前難以從CAR-T細(xì)胞移植療法治療中獲益。

2.4 腫瘤細(xì)胞抗原丟失或缺失 靶抗原丟失是引起CAR-T細(xì)胞移植療法治療后疾病復(fù)發(fā)的潛在因素之一。目前已知的CD19抗原丟失的機(jī)制是，基因選擇性剪接導(dǎo)致細(xì)胞表面CD19表達(dá)降低或翻譯出異型CD19蛋白破壞靶表位[23]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞表面抗原表達(dá)量減少或密度下降至一定程度時(shí)，腫瘤細(xì)胞即可逃避CAR-T細(xì)胞攻擊而引起腫瘤復(fù)發(fā)，而個(gè)體間最低抗原密度閾值差異則是導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥的原因之一[24]。雖然有研究[25]報(bào)道，部分患者存在CD19陰性的惡性B細(xì)胞的祖細(xì)胞，但實(shí)際只有很少的患者在診斷時(shí)檢測出CD19陰性或少量表達(dá)CD19的惡性B細(xì)胞[26]，而在KMT2A(MLL)基因重排的ALL嬰兒患者中常檢測到CD22陰性的細(xì)胞亞群[27]，因此患者在接受CAR-T治療前還應(yīng)進(jìn)行更加詳細(xì)的抗原表達(dá)分析檢測。目前流式細(xì)胞術(shù)在監(jiān)測最小殘留病灶、預(yù)測患者預(yù)后中扮演重要角色，當(dāng)腫瘤負(fù)擔(dān)較輕時(shí)則需要更復(fù)雜的流式細(xì)胞術(shù)門控方法及其他檢測單細(xì)胞免疫表型特征的技術(shù)，來預(yù)測患者發(fā)生抗原丟失性腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。而對于那些CAR-T細(xì)胞療法未完全消除但流式細(xì)胞術(shù)難以檢測的惡性細(xì)胞群引起的腫瘤復(fù)發(fā)，可以通過采用輔助PCR技術(shù)以及免疫球蛋白重鏈(IgH)VDJ重排分子評估技術(shù)隨時(shí)間追蹤腫瘤細(xì)胞來預(yù)測。鑒于抗原丟失是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸CAR-T細(xì)胞移植療法治療的重要機(jī)制之一，研究者們嘗試構(gòu)建多抗原靶向的CAR結(jié)構(gòu)以應(yīng)對腫瘤的固有異質(zhì)性并試圖以此降低疾病復(fù)發(fā)的可能?，F(xiàn)已有證明多靶點(diǎn)CAR結(jié)構(gòu)有效性的臨床前數(shù)據(jù)發(fā)表[28]，同時(shí)相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)也正在進(jìn)行中。

2.5 細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS) CRS是CAR-T細(xì)胞移植療法治療最常見的相關(guān)毒性反應(yīng)[24,29,30]。目前CRS臨床管理指南的制定主要參考了CD19 CAR-T細(xì)胞的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但不同靶向抗原的CAR-T細(xì)胞引起的CRS相關(guān)臨床特征不盡相同，例如在接受CD22 CAR-T細(xì)胞移植療法治療的患者中觀察到的CRS反應(yīng)不似在CD19 CAR-T細(xì)胞移植療法治療中嚴(yán)重[24]，但CD22 CAR-T細(xì)胞移植療法治療會引發(fā)如凝血病等其他毒性反應(yīng)，因此應(yīng)對CAR-T細(xì)胞移植療法治療的毒性反應(yīng)的干預(yù)策略應(yīng)更具有針對性。目前數(shù)據(jù)表明早期干預(yù)可以在有效地降低CRS的嚴(yán)重程度的同時(shí)不破壞CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增峰值及療效的持久性，但是這一數(shù)據(jù)僅來自采用一種CAR結(jié)構(gòu)的單一試驗(yàn)，因此可能需要開展更多的研究來證實(shí)。未來，如何在發(fā)揮CAR-T細(xì)胞療效最大化的前提下，尋找最佳干預(yù)措施及最佳干預(yù)時(shí)機(jī)來減輕或避免CRS等毒性反應(yīng)將是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的研究課題。目前一項(xiàng)關(guān)于研究托珠單抗聯(lián)合抗IL-6療法治療CD19 CAR-T細(xì)胞相關(guān)CRS最佳時(shí)機(jī)的臨床實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。

綜上所述，CAR-T細(xì)胞移植療法治療是目前極具前景的腫瘤免疫療法之一，在篩選患者、采集T細(xì)胞、制備CAR-T細(xì)胞、CAR-T細(xì)胞體外擴(kuò)增、移植CAR-T細(xì)胞、CAR-T細(xì)胞體內(nèi)活化與擴(kuò)增等實(shí)施CAR-T細(xì)胞移植療法治療的每一個(gè)步驟中都存在著能夠影響最終治療效果的因素。許多臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，仍存在部分患者在接受CAR-T細(xì)胞移植療法治療后未能獲得長期緩解，且CAR-T細(xì)胞移植療法對于部分因腫瘤細(xì)胞抗原丟失而致復(fù)發(fā)的患者療效甚微。與此同時(shí)，CAR-T細(xì)胞的毒性反應(yīng)也限制了其廣泛應(yīng)用。但正是這些影響因素提示人們更加有方向性地探索CAR-T細(xì)胞移植療法所面臨的問題。在這個(gè)快速發(fā)展的研究領(lǐng)域，人們更加應(yīng)該將研究重點(diǎn)落在克服已發(fā)現(xiàn)的問題上，這樣在不久的將來CAR-T細(xì)胞移植療法將會得到更廣泛地應(yīng)用。