王露瑤，呂娟，阮紅杰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/南京市婦幼保健院，南京210004)

盡管目前的手術(shù)和放化療能夠減小腫瘤的體積和延長患者的生命，但腫瘤復(fù)發(fā)和多藥耐藥的發(fā)生仍是目前腫瘤治療的兩大障礙。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)理論認(rèn)為，腫瘤是異質(zhì)性細(xì)胞群體，存在著一小部分類似于胚胎干細(xì)胞、具有無限自我更新和分裂能力的類干細(xì)胞，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1～3]。常規(guī)的放化療主要是針對普通的腫瘤細(xì)胞，而CSCs對此并不敏感。同時(shí)，隨著放化療的刺激作用及普通腫瘤細(xì)胞的清除，改變了CSCs的微環(huán)境，CSCs得到富集，增殖侵襲轉(zhuǎn)移的能力進(jìn)一步增強(qiáng)，并且對化療藥物表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性，對藥物的敏感性降低，甚至無反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)，說明CSCs在腫瘤耐藥中發(fā)揮了重要作用。對CSCs耐藥機(jī)制的研究將有助于腫瘤治療新思路的開拓。研究[4]發(fā)現(xiàn)，CSCs主要通過自身的生物學(xué)特性和腫瘤微環(huán)境的保護(hù)作用而在腫瘤耐藥中發(fā)揮作用，現(xiàn)將相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 CSCs的生物學(xué)特性

美國癌癥研究協(xié)會(AACRl3)定義CSCs為：腫瘤中能夠自我更新，并產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。研究[2,6]顯示，將少量的CSCs種植于小鼠體內(nèi)能重塑整個(gè)腫瘤的表型，因此常常導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)、耐藥和轉(zhuǎn)移。和正常的干細(xì)胞一樣，CSCs高表達(dá)干性基因NANOG、OCT4、SOX2等，還有干性信號通路的激活，以此維持CSCs的干性，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CSCs的生物學(xué)特性決定了CSCs不同于普通的腫瘤細(xì)胞。CSCs通常隱匿在癌巢中，處于靜止?fàn)顟B(tài)，DNA復(fù)制不活躍，能夠逃避化療藥物誘導(dǎo)的DNA損傷作用，對DNA損傷的修復(fù)能力增強(qiáng)，保持基因的穩(wěn)定遺傳。CSCs的這些生物學(xué)特性受到胞內(nèi)和胞外復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制。

1.1 細(xì)胞周期阻滯 CSCs通常處于休眠狀態(tài)，增殖不活躍。大部分的化療藥物主要是針對分裂中的腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞通常處于G2/S期，而CSCs處于G0/G1期，對化療藥物并不敏感。因放化療的作用，消除了普通腫瘤細(xì)胞，使CSCs得到富集。同時(shí)，也因化療藥物的刺激作用，靜止的CSCs迅速蘇醒，進(jìn)入細(xì)胞周期，迅速增殖分裂，重構(gòu)整個(gè)腫瘤的表型，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。CSCs休眠狀態(tài)需要自身特性和外部環(huán)境因素的共同作用的維持。在對胰腺癌CSCs的研究[7]中發(fā)現(xiàn)，耐藥的腫瘤球體細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑P21和腫瘤抑制因子P53的表達(dá)升高，而細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)降低，細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，對普通化療藥物不敏感，常常導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。乙醛脫氫酶1(ALDH1)常常作為CSCs分選標(biāo)志,可以將醛類氧化成羧酸類，抵抗烷化劑的損傷作用，高表達(dá)于CSCs表面。Meng等[8]發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌CSCs中，ALDH1表達(dá)陽性的CSCs對化療藥物的敏感性明顯降低，ALDH1A通過調(diào)節(jié)KLF4和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑P21蛋白調(diào)整細(xì)胞周期，細(xì)胞停滯于對化療藥物不敏感的G0/G1期，從而抵抗藥物的殺傷作用。此外，糖原合成酶激酶-3(GSK-3)通過Wnt/β-catenin促進(jìn)β-catenin泛素化，阻斷下游靶標(biāo)細(xì)胞周期蛋白-1、c-Myc等的激活，抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程。Haraguchi等[9]發(fā)現(xiàn)，生長分化因子15(GD15)可以通過AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路增加肝CSCs在G0/G1期的細(xì)胞比例，增強(qiáng)肝CSCs的成球能力及對化療藥物的抵抗力。因此，細(xì)胞周期阻滯可以保護(hù)CSCs抵抗化療藥物的損傷，打破CSCs的休眠狀態(tài)可以作為新的治療方向。

1.2 DNA損傷耐受及DNA損傷修復(fù) 目前一部分化療藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA損傷來發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用的，而CSCs不但處于休眠期，還具有極強(qiáng)的DNA損傷耐受及DNA損傷修復(fù)能力。其主要機(jī)制為，一方面通過切除修復(fù)去掉DNA受損部分，另一方面通過增強(qiáng)重組修復(fù)稀釋損傷的DNA鏈。腫瘤化療藥物順鉑主要是抑制腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。Srivastava等[10]發(fā)現(xiàn)，卵巢CSCs中高表達(dá)DNA聚合酶Polη，通過促進(jìn)跨損傷DNA合成，跳過損傷的DNA復(fù)制點(diǎn)，可以逃避順鉑的損傷作用。此外，對DNA損傷的修復(fù)還可通過增強(qiáng)對DNA雙鏈斷裂(DSBs)的修復(fù)來完成。Gold等[11]發(fā)現(xiàn)，新型抗癌藥物螺內(nèi)酯抗腫瘤的作用機(jī)制，就是通過抑制腫瘤細(xì)胞的DSBs修復(fù)來完成的。因?yàn)槁輧?nèi)酯對完好的CSCs并不起作用，僅對發(fā)生DSBs的CSCs的DNA修復(fù)有抑制作用，解除CSCs的DNA損傷耐受、抑制CSCs的DNA修復(fù)，可以干擾CSCs的正常分裂，從而消除CSCs，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)及耐藥，提高腫瘤清除率。

1.3 藥物外排 化療藥物發(fā)揮殺傷作用需要一定的藥物濃度，CSCs與普通腫瘤細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度較低，這與CSCs表面高表達(dá)多藥耐藥蛋白(MDR)有關(guān)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族是一類MDR，即ATP結(jié)合盒蛋白，能夠利用ATP水解釋放的能量將治療藥物排出胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)有效的藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤的耐藥及復(fù)發(fā)。此外，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還可作為腫瘤的預(yù)后因子，ABC亞家族C成員2(ABCC2)、ABCC3和ABC亞家族G成員2(ABCG2)作為CSCs的標(biāo)志物，其表達(dá)與結(jié)腸癌患者的預(yù)后相關(guān)，可以作為結(jié)腸癌預(yù)后的預(yù)測因子。由于一種藥物可由多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排出，單獨(dú)抑制某一種特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，無法阻礙藥物的外排，這也是阻礙靶向藥物成功運(yùn)用于臨床的一大障礙。Wu等[12]發(fā)現(xiàn)，靶向藥物酪氨酸酶抑制劑tepotinib可以抑制ABCB1介導(dǎo)的藥物外排，但是不能阻斷ABCG2、ABCC1的外排作用。因此，進(jìn)一步探究ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控機(jī)制，對恢復(fù)抗腫瘤藥物殺傷作用來說至關(guān)重要。

1.4 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) EMT，即上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的特性而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的特性，并獲得侵襲轉(zhuǎn)移的能力。EMT在產(chǎn)生CSCs中起著關(guān)鍵作用，與CSCs的生物學(xué)特性及耐藥現(xiàn)象緊密相關(guān)。目前認(rèn)為，一部分CSCs由已分化的腫瘤細(xì)胞去分化產(chǎn)生。Li等[13]研究表明，調(diào)控EMT過程的轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)，如snail、slug等，可以誘導(dǎo)已分化的腫瘤細(xì)胞去分化轉(zhuǎn)化為CSCs，并介導(dǎo)化學(xué)抗性。Shuang等[14]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EMT的惡性腫瘤細(xì)胞，干性基因的表達(dá)有所增強(qiáng)，表明發(fā)生EMT能使腫瘤細(xì)胞去分化為CSCs，獲得干性特征。與此同時(shí)，CSCs高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌懸浮球培養(yǎng)的球體細(xì)胞高表達(dá)干性標(biāo)志物CD44+、NANOG的同時(shí)，snail等EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也升高。Gao等[16]發(fā)現(xiàn)，在肝CSCs中CD44+的肝CSCs高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白，而低表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物；去除CD44+CSCs,可以通過抑制ERK/Snai信號通路，減少肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)[17,18]表明EMT與CSCs之間的直接聯(lián)系，共同促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。EMT是一個(gè)動態(tài)的、可逆的過程，因此，通過直接靶向作用某個(gè)或某幾個(gè)EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并不能抑制EMT的發(fā)生。探究EMT與CSCs之間的作用機(jī)制，對腫瘤的治療來說是至關(guān)重要的。

2 CSCs生存的腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)

CSCs的耐藥除了與其干性特征相關(guān)外，還受腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)。單個(gè)的CSCs無法獨(dú)自存活，需要腫瘤微環(huán)境的支持。腫瘤微環(huán)境不僅包括腫瘤細(xì)胞本身，還有與腫瘤相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞、微血管、細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞因子。腫瘤微環(huán)境是一種動態(tài)變化的環(huán)境，受腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展促腫瘤微環(huán)境的形成，微環(huán)境的低氧、低PH、微量葡萄糖供應(yīng)進(jìn)一步維持CSCs的干性和提高耐藥能力。CSCs的休眠狀態(tài)能夠適應(yīng)微環(huán)境中低能量供應(yīng)，一旦環(huán)境發(fā)生改變，CSCs能量利用方式隨之改變，進(jìn)入增殖期擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞[19]。所以，CSCs所處的腫瘤微環(huán)境是維持干性、驅(qū)動腫瘤發(fā)展、復(fù)發(fā)及耐藥的重要因素。同種腫瘤在不同腫瘤微環(huán)境中，其基因表達(dá)和生物學(xué)行為之間具有顯著的差異性，可能與腫瘤微環(huán)境的差異相關(guān)。鑒于CSCs與腫瘤微環(huán)境相互作用關(guān)系，腫瘤微環(huán)境可以作為腫瘤治療的新的靶點(diǎn)，改變CSCs生存的環(huán)境，增加對藥物的敏感性。

2.1 低氧環(huán)境 低氧環(huán)境是腫瘤微環(huán)境的一大特點(diǎn)，是維持CSCs的干性的重要條件。低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)CSCs的干性、促進(jìn)EMT的發(fā)生以及產(chǎn)生更強(qiáng)的耐藥。低氧環(huán)境下眾多的信號通路處于激活狀態(tài)，主要是由缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)介導(dǎo)的一系列級聯(lián)反應(yīng)。HIF-1幾乎參與細(xì)胞代謝的每個(gè)過程，涉及腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥。在低氧狀態(tài)下，HIF-1降解途徑被抑制，導(dǎo)致HIF-1及其調(diào)節(jié)的靶基因如NANOG等在CSCs中的表達(dá)普遍高于非CSCs[20]。Sun等[21]發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境下，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)/ATK信號通路的活化可以激活HIF-1α，提高CSCs抵抗化療藥物的能力。低氧環(huán)境還可以維持CSCs的休眠狀態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡，抵抗藥物的殺傷作用。Li等[22]發(fā)現(xiàn)，HIF-2α在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞中明顯高表達(dá)，通過干擾HIF-2α的表達(dá)可以促進(jìn)CSCs的凋亡。

2.2 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs) 腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞及非腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，CAFs、巨噬細(xì)胞(M2細(xì)胞)是其中最重要的兩種間質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠分泌不同的細(xì)胞因子和生長因子，包括VEGF、IL-10和IL-17等，通過調(diào)節(jié)CSCs促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。CAFs受腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞生長因子、TGF-β的作用而激活，分泌大量的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)CSCs的增殖、維持CSCc的干性。此外，CAFs分泌的Annexin A1還能夠促進(jìn)前列腺癌CSCs的增殖。Cazet等[23]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的異種移植實(shí)驗(yàn)中，與單純移植CSCs相比，將CSCs和CAFs共同移植，其成瘤能力顯著增強(qiáng)。此外，CAFs能夠誘導(dǎo)已分化的腫瘤細(xì)胞去分化恢復(fù)CSCs表型。Vermeulen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，由于CAFs分泌肝細(xì)胞生長因子(HGF),通過作用于酪氨酸激酶受體c-Met激活Wnt信號通路，使位于結(jié)腸癌邊緣的腫瘤細(xì)胞表達(dá)更高的干性特征，導(dǎo)致結(jié)腸癌的耐藥及復(fù)發(fā)。CAFs不僅能夠維持CSCs的干性表型，同時(shí)自身高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,為CSCs創(chuàng)造相對低藥物濃度的微環(huán)境。CAFs還能夠誘導(dǎo)CSCs代謝的改變，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Renner等[25]研究發(fā)現(xiàn)，CAF分泌的細(xì)胞因子能夠增強(qiáng)CSCs膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，增加細(xì)胞對葡萄糖的攝取，供給細(xì)胞增殖所需的能量。Su等[26]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，CAFs通過為CSCs提供適宜的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤發(fā)展及耐藥。通過靶向根除CAFs，破壞CSCs賴以生存的微環(huán)境，可以阻礙乳腺癌的發(fā)展，恢復(fù)對化療藥物的敏感性。因此，靶向作用于CAFs可以作為一種有效的治療策略。

2.3 慢性炎癥 雖然早期的炎癥反應(yīng)能夠聯(lián)合機(jī)體的免疫系統(tǒng)抑制腫瘤的形成，慢性炎癥卻是腫瘤擴(kuò)張的主要誘因。Kim等[27]發(fā)現(xiàn),IL-6作為免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，可以通過IL-6-JAK1-STAT3信號通路的激活靶向OCT4基因，導(dǎo)致CSCs增殖，誘導(dǎo)非腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CSCs。慢性炎癥還會造成低氧的環(huán)境。Manupati等[28]研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子EGFR通過環(huán)氧化酶-2(COX-2)調(diào)節(jié)乳腺癌CSCs的自我更新。研究[29]表明，慢性炎癥與CSCs相互促進(jìn)，如核因子κB-(NF-κB-)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)增加了腫瘤細(xì)胞的干性，而CSCs表達(dá)NF-κB-的水平升高，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥的形成。最新的研究[25,30]表明，腫瘤細(xì)胞免疫逃避和糖代謝增強(qiáng)是相互關(guān)聯(lián)的，并受腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)。癌癥相關(guān)的免疫細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞，由于腫瘤微環(huán)境中的缺氧狀態(tài)，細(xì)胞產(chǎn)生大量的乳酸，而過量的乳酸可以使得MI型的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型的巨噬細(xì)胞，M2型的巨噬細(xì)胞可以分泌TGF-β1、EGF等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)CSCs的增殖，增強(qiáng)CSCs的侵襲轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此抗腫瘤治療中輔以抗炎治療，可以打破CSCs依賴的生存條件。

綜上所述，細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷耐受及DNA損傷修復(fù)、藥物外排、EMT等CSCs的生物學(xué)特性，低氧環(huán)境、CAFs、慢性炎癥等腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)，共同維持CSCs的干性特征,抑制化療藥物對CSCs的刺激作用，加大了腫瘤治療的困難性。通過對CSCs耐藥機(jī)制的研究可以指導(dǎo)開發(fā)新的針對CSCs的靶向治療，聯(lián)合傳統(tǒng)的治療策略，同時(shí)消除CSCs和腫瘤細(xì)胞，提高腫瘤的治療效果。