王茹月 葉雨

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科（南寧530021）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率已連續(xù)多年居男性惡性腫瘤發(fā)病率首位，病死率居前三位［1］。中國PCa 發(fā)病率雖低于歐美國家，但隨著人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來也呈逐年上升趨勢［2］。早期發(fā)現(xiàn)和確診對于惡性腫瘤的防治至關(guān)重要，而由于傳統(tǒng)的PCa 臨床診斷指標血清PSA 特異性較低，在良性前列腺疾病中其表達水平亦可出現(xiàn)異常升高，尋找更加準確的生物標志物并與PSA 結(jié)合應(yīng)用是眾多學(xué)者追尋的方向。

分子診斷技術(shù)通過對機體內(nèi)源性或外源性生物分子的檢測輔助臨床診斷、監(jiān)測和治療，是近年來的研究熱點。其中循環(huán)游離核酸（circulating cell?free nucleic acid，cf?NA）檢測是針對血循環(huán)中游離于細胞外的核酸分子片段，檢測其表達量或突變。cfNA 種類和數(shù)量豐富，并且取樣相對無創(chuàng)、成本低，具有優(yōu)越的開發(fā)應(yīng)用潛能。目前的研究表明，血循環(huán)DNA、長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）和短鏈非編碼RNA 中的微小RNA（microR?NA，miRNA）以及一些信使RNA（messenger RNA，mRNA）在PCa 診斷中準確度較高，具有很好的應(yīng)用前景。本文對這些外周血循環(huán)游離核酸的研究進展進行了概述。

1 外周血DNA

循環(huán)游離DNA（circulating cell?free DNA，cfDNA）是細胞凋亡或者其他形式的細胞死亡后釋放到血漿中的DNA片段，可以通過分光光度法、熒光染色法、PCR、DNA 測序、分支鏈DNA 信號放大技術(shù)（branched DNA，bDNA）等先進技術(shù)手段，從表達水平、完整性、甲基化和突變多個方面評估PCa 外周血cfDNA 的特性。

1.1 DNA 定量測定 由于惡性腫瘤增殖迅速，細胞凋亡壞死后會釋放大量循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumour DNA，ctDNA）并被核酸酶降解，PCa 患者通常比良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）患者和健康對照組具有更高水平的血漿cfDNA 濃度和更低的cfDNA 完整性［3］。在健康狀態(tài)和一些非腫瘤性疾?。ㄈ缪装Y）時，機體內(nèi)也會存在低水平cfDNA，會干擾測定，且腫瘤發(fā)生初期cfDNA 濃度增加可能并不明顯，導(dǎo)致DNA 定量檢測作為PCa 早期診斷方法準確度不高。但是有研究表明［4］，血漿cfDNA 水平與PCa 轉(zhuǎn)移及腫瘤分期顯著相關(guān)，或許可以用于監(jiān)測PCa的病情進展及術(shù)后復(fù)發(fā)情況。

1.2 DNA 甲基化 DNA 甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，甲基基團以共價結(jié)合方式結(jié)合到基因啟動子cpG 島的特定區(qū)域，從而調(diào)節(jié)基因的表達，在PCa 發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1 基因（GSTP1）位于染色體11q13，它的啟動子甲基化是PCa 最常見的DNA 改變。研究表明，檢測血漿谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1 基因（GSTP1）啟動子甲基化用于診斷PCa 的靈敏度和特異性都很高（分別為95%和87%），預(yù)測準確率達到93%［5］。REIS 等［6］利用血清PSA、cfDNA 濃度和血清GADD45a 基因甲基化聯(lián)合診斷PCa，具有94.1%的靈敏度和87.5%的特異性，AUC 達到0.937。HALDRUP 等［7］成功檢測到了血清中高度PCa 特異性的4 種甲基化ctDNA（ST6GALNAC3、ZNF660、HAPLN3和CCDC181）并開發(fā)出了一套ctDNA 預(yù)測模型，檢測PCa具有100%的特異性和67%的靈敏度。此外，許多具有PCa診斷潛能的組織特異性DNA 遺傳學(xué)改變，均可能在血循環(huán)中被檢測到，如APC、RASSF1A、RAR?b、PCDH10、HIC1等基因的甲基化，尚有待進一步研究。作為一種重要的表觀遺傳學(xué)標志，血循環(huán)cfDNA 甲基化出現(xiàn)時間早于經(jīng)典遺傳和生理生化改變［8］，并與癌癥化療反應(yīng)和總生存期（overall survival，OS）相關(guān)［9］，開發(fā)應(yīng)用前景良好，是一種優(yōu)越的PCa 早期診斷標志物。

1.3 DNA 遺傳學(xué)改變 DNA 遺傳學(xué)改變是基因序列的改變，包括基因突變、基因雜合丟失（loss of heterozygosity，LOH）和 微衛(wèi)星不 穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）等。基因突變發(fā)生在堿基對水平，癌基因的激活與抑癌基因的失活與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。癌癥發(fā)生是多個基因突變共同作用的結(jié)果，因此多基因位點聯(lián)合檢測具有較大的價值。如SCHüTZ 等［10］開發(fā)出一組血循環(huán)DNA 突變組合，用于診斷PCa 的AUC 高達0.92。此外，研究人員最近進行的人類全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)了多個遺傳性PCa 發(fā)病風險相關(guān)突變位點，如AR、SPOP、ETS、P53 和PTEN 等基因的畸變，它們在血液中的改變或許同樣具有診斷意義。短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）又稱微衛(wèi)星，廣泛存在于人類基因組。重復(fù)單元的插入或缺失會導(dǎo)致腫瘤細胞中STR 長度改變，是PCa 發(fā)生的重要機制之一?；螂s合丟失是指兩個等位基因中的一個發(fā)生的序列缺失，常發(fā)生在腫瘤細胞的抑癌基因位點。SEYEDOLMO?HADESSIN 等［11］發(fā)現(xiàn)，血漿短串聯(lián)重復(fù)序列發(fā)生的雜合丟失可以幫助鑒別PCa，在他們的研究中有71.05%的PCa 患者具有至少3 種LOH 標記。

由上述研究可知，cfDNA 用于前列腺癌診斷的敏感性和特異性都很高。最近WYATT 等［12］的研究表明，對轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌（metastatic castration resistant pros?tate cancer，mCRPC）患者進行ctDNA 檢測足以識別匹配的組織活檢中存在的所有DNA 改變，因此是一種很有前景的無創(chuàng)性替代診斷方法。但由于外周血cfNA 是來自于腫瘤細胞片段DNA 釋放，豐度相對較低，半衰期短，對采樣時間、樣品保存要求高，需要更加精準的檢測手段。最近，數(shù)字PCR 已成為檢測cfDNA 點突變的敏感工具，一些新方法與檢測系統(tǒng)不斷出現(xiàn)（如結(jié)合數(shù)字PCR 與流式技術(shù)的BEAMing 系統(tǒng)）。相信隨著技術(shù)的進步，血循環(huán)cfDNA 將給PCa 的診斷帶來突破性進展。

2 外周血lncRNA

LncRNA 是長度＞200 nt（核苷酸）的非編碼RNA，它并不編碼蛋白質(zhì)，但與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。外周血lncRNA 由活細胞或循環(huán)腫瘤細胞分泌，以微泡、外泌體或與蛋白分子結(jié)合形式穩(wěn)定存在于血清、血漿或血細胞，可以通過實時熒光定量PCR（qRT?PCR）、基因芯片、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA?Seq）和RNA 熒光原位雜交（RNA?FISH）等手段進行定性定量分析。血lncRNA 用于PCa 診斷的相關(guān)研究較少，目前發(fā)現(xiàn)較有前景的是前列腺癌抗原3（prostate can?cer antigen 3，PCA3）和MD?miniRNA。

2.1 PCA3 PCA3 位于染色體9q21?22，也稱DD3，是當前最熱門的PCa 標記物之一。PCA3 在PCa 中呈特異性高表達，在正常前列腺、良性前列腺增生組織中不表達或低表達。在尿液中檢測PCA3 協(xié)助PCa 診斷的“PROGENSA PCA3 測試”已于2012年經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市。近年來研究表明，血液PCA3 作為PCa生物標志物也表現(xiàn)出良好的應(yīng)用價值，診斷特異性很高（94%），但敏感性欠佳（32%）［13］。此外，血lncRNA PCA3的水平在Gleason 評分≥8 的高級別PCa 患者中明顯高于Gleason 評分≤7 的患者，可以幫助評估腫瘤的惡性程度和侵襲性［14］。

2.2 MALAT1 源MD?miniRNA MD?miniRNA 是lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1（metastasis?associated lung adeno?carcinoma transcript 1，MALAT1）含量最多的血漿片段形式，也具有很強的特異性。在組織和尿液中檢測這種ln?cRNA 作為PCa 生物標志物的價值已得到越來越多的肯定。REN 等［15］和XUE 等［16］的研究表明，將外周血MD?miniRNA 應(yīng)用于PCa 診斷雖然敏感性稍低（在2 個研究中分別為58.6%和76%），但特異性有優(yōu)勢（在2 個研究中分別為84.8%和90%），受試者曲線下面積大于血清PSA（0.836vs.0.770），特別是當血清PSA 水平處于4～10 ng/mL（PSA 診斷的“灰色區(qū)域”）時這種優(yōu)勢更顯著。因此可以推測，血漿MALAT1 源MD?miniRNA 可能較適于當PSA 處于灰色區(qū)域時用于增加PCa 的診斷準確度。這兩個實驗的研究數(shù)據(jù)都來源于國內(nèi)人群，因此對中國人而言血MD?miniRNA 可能是一種很有前景的生物標志物，與特異性稍差的PSA 聯(lián)合是值得期待的應(yīng)用方向，可以減少良性病變的誤診，增強PSA 的診斷效能。

綜合以上研究，外周血lncRNA 單獨診斷PCa 的特異性強，但敏感性低，因此較適于與靈敏度強的其他標志物聯(lián)合使用?？紤]到血檢不需要進行組織穿刺或排尿前前列腺按摩，患者耐受程度更好，且受取樣點、操作方式等因素影響小，包含lncRNA 的血液標志物聯(lián)合檢測可能是優(yōu)于PSA、lncRNA 組織活檢和尿檢的PCa 早期診斷指標。因此，在未來的研究中繼續(xù)尋找PCa 特異性lncRNA 血循環(huán)片段作為診斷標志物具有廣闊的探索前景。

3 外周血miRNA

MiRNAs 為20～24 nt 長度的小分子片段，與轉(zhuǎn)錄后基因表達與調(diào)控相關(guān)。MiRNAs 在外周血中以脂質(zhì)或脂蛋白復(fù)合物如凋亡小體、微泡或外泌體等形式存在［17］，具有抗內(nèi)源性核糖核酸酶活性，穩(wěn)定性和豐度都很高，可以通過Northern blot、微點陣分析和qRT?PCR 等方法進行檢測。自從2008年有學(xué)者第一次發(fā)現(xiàn)血miR?141 水平可以區(qū)分PCa患者和健康個體（靈敏度60%，特異性100%），越來越多的PCa 特異性血循環(huán)miRNAs 被發(fā)現(xiàn)。

3.1 單一miRNA 作為PCa 診斷生物標志物

3.3.1 MiR?375 研究表明，血清miR?375 鑒別PCa 的效力優(yōu)于PSA（兩者的AUC 分別為0.720 和0.603），聯(lián)合尿激酶型纖溶酶原激活物受體蛋白診斷準確度更高（AUC 值由0.720 增加到0.755）［18?19］。另一項研究表明，血漿來源的miR?375 同樣具有良好的PCa 診斷效能，優(yōu)于PSA（AUC 分別為0.809 和0.710）［20］。

3.3.2 MiR?21 YAMAN 等［21］測量了51 例PCa 患者和20名健康對照的血液miR?21 水平，發(fā)現(xiàn)病例組和對照組間存在的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），miR?21 具有很好的PCa 診斷效能，AUC＝0.88。KOTB 等［22］對20 例PCa 疑似病例進行的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，血清miR?21 具有比PSA ≥10 ng/mL 更高的預(yù)測診斷潛能（敏感性90%，特異性90%）。然而，在YAMAN 等［21］發(fā)表的研究成果中，未報道m(xù)iR?21 與血清PSA 進行診斷效能比較的數(shù)據(jù)；而KOTB等［22］的實驗樣本量太小，因此兩個實驗的結(jié)果尚不足以說明外周血miR?21 單獨應(yīng)用具有超越血清總PSA 的PCa 診斷價值，有待進一步研究驗證。

3.3.3 MiR?628?5p SRIVASTAVA 等［23］進行血清miRNAs表達譜分析發(fā)現(xiàn)PCa 特異性最強的miRNA 是miR?628?5p（P＜0.000 1），在臨床研究中診斷PCa 的AUC 高達0.94，或許具有良好的應(yīng)用價值。目前miR?628?5p 對于中國人種的PCa 診斷價值尚未見文獻報道，可以考慮在中國人群進行大樣本驗證。

3.3.4 MiR?410?5p WANG 等［24］首次發(fā)現(xiàn)PCa 患者外周血樹突狀細胞中miR?410?5p 的表達異常增高（比非癌患者高達7.5 倍），用于早期診斷具有很好的效能（AUC＝0.809 7），與PSA 結(jié)合使用效能更高（AUC＝0.827 4），并可用于評估腫瘤的惡性程度和預(yù)后。

除了上述幾種miRNAs，最近研究發(fā)現(xiàn)有PCa 早期診斷價值的指標還包括miR?320 家族（miR?320 a/?b/?c），3 種miRNA 區(qū)分PCa 和健康對照組的AUC 分別為0.894、0.714和0.840［25］。外周血miRNAs 應(yīng)用于PCa 早期診斷敏感度、特異性都很好，且有研究表明基于血液的miRNA 的檢測具有比非血來源miRNA 檢測更高的敏感性［26］，因此被認為是最有研究價值的生物標志物種類之一。許多在惡性腫瘤中呈現(xiàn)普遍異常表達的miRNAs，均被報道具有PCa診斷價值。這些發(fā)現(xiàn)若經(jīng)大樣本人群驗證，將有望應(yīng)用于臨床工作中。除了很好的早期診斷潛能，外周血miRNAs還與腫瘤分期、根治性前列腺切除術(shù)后生化復(fù)發(fā)等臨床病理特征相關(guān)［18，25］，可以幫助評估患者的病情和預(yù)后。

3.2 miRNAs 聯(lián)合診斷模型 當前越來越多的學(xué)者致力于建立生物標志物聯(lián)合診斷模型，以進一步增加PCa 的預(yù)測準確度。文獻已報道了多個得到臨床驗證的模型，如miR?141、miR?21 和miR?375 聯(lián)合模型，miR?141、miR?145、miR?155 和let?7a 聯(lián)合模型，miR?16?5p 和%fPSA（血清游離PSA 和總PSA 的比值）聯(lián)合模型，miR?4289、miR?326、miR?152?3p 和miR?98?5p 聯(lián)合模型［19，27?29］，以及DANIEL 等［30］實驗中檢測到的7 種在PCa 患者血液中特異性表達的mi?croRNAs 聯(lián)合模型（由上調(diào)的miR?127?3p、miR?204?5p、miR?329?3p、miR?487b?3p 和下調(diào)的miR?32?5p、miR?20a?5p、miR?454?3p 組成），均具有優(yōu)于單一指標的PCa 診斷效能。由于不同種族間生物標志物的診斷價值可能存在差異，參考上述研究結(jié)果進行大樣本人群驗證以開發(fā)出更多適于中國人群的血miRNAs 聯(lián)合診斷模型，是很有意義的研究方向。

4 外周血mRNA

除了外周血cfDNA、lncRNA 和miRNA，部分血循環(huán)蛋白mRNA 和基于腫瘤的血小板（tumor?educated platelets，TEPs）mRNA 也具有很好的PCa 診斷準確度。

4.1 蛋白mRNA 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)以及高通量測序技術(shù)的發(fā)展，許多循環(huán)蛋白分子被檢測到發(fā)生了PCa 特異性表達改變。mRNA 攜帶蛋白質(zhì)的全部遺傳信息，可以反映器官或組織的異?；虿±頎顟B(tài)。早在2012年就有學(xué)者采用平均差異表達方法檢測了全血RNA 生物標志物，發(fā)現(xiàn)環(huán)指蛋白RNF19A 的mRNA 在PCa 患者血液中表達量明顯增高（超出健康對照組2 倍水平），診斷PCa 的AUC＝0.727（作為參考的PSA 的AUC 值范圍0.640～0.678）［31］。此外，端粒位于染色體末端，與細胞分裂有關(guān)，腫瘤細胞中常常存在端粒酶活性的異常激活。MARCH?VILLALBA 等［32］的實驗表明，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）mRNA 可能是一種有用的PCa 診斷標志物，比血清PSA 顯示出更高的敏感性（85%vs.83%）、特異性（90%vs.47%）、陽性預(yù)測值（83%vs.56%）和陰性預(yù)測值（92%vs.77%）。

由于血循環(huán)mRNA 水平受到多種因子調(diào)節(jié)，如蛋白表達量、核酸酶、上游的DNA 和非編碼RNA 等，與蛋白表達量不一定成正比，僅僅檢測蛋白mRNA 是不夠的。血循環(huán)蛋白分子研究常將蛋白組學(xué)內(nèi)容（如蛋白表達量的變化、翻譯后修飾，細胞定位改變）與轉(zhuǎn)錄組學(xué)內(nèi)容（檢測血漿蛋白mRNA）結(jié)合，尋找PCa 診斷特異性蛋白。如在多種癌癥中呈現(xiàn)異常表達的高爾基體磷蛋白3（GOLPH3）和肝配蛋白?A2（Ephrin?A2），最近都被證明是有前景的PCa 血循環(huán)診斷標志物［33?34］，此外，GOLPH3 水平還被證明與格里森評分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)［34］。

4.2 TEPs mRNA 近年來研究人員發(fā)現(xiàn)，血小板能夠釋放一種抑制免疫T 細胞活性的分子—TGF?β，導(dǎo)致腫瘤細胞的“免疫逃逸”［35］，與癌癥的發(fā)生和遷移關(guān)系密切。BEST M G 提出對TEPs 進行mRNA 測序可用于診斷癌癥，TEPs 區(qū)分癌癥患者與健康人的準確率達96%［36?37］。但這種測序診斷方法尚未在PCa 中得到驗證，因此可以考慮納入未來的研究方向。

有研究表明，腫瘤細胞中mRNA 的突變區(qū)拷貝數(shù)要遠遠多于DNA 的突變區(qū)拷貝數(shù)［38］，診斷特異性比DNA 更強，但由于外周血mRNA 種類繁雜，靈敏度和豐度較差，結(jié)構(gòu)相對不穩(wěn)定，限制了其單獨應(yīng)用價值，但或許可以應(yīng)用于分子聯(lián)合診斷，有待繼續(xù)研究驗證。

5 總結(jié)與展望

隨著分子診斷技術(shù)的不斷進步，人們有望開發(fā)出靈敏度和特異性更好的PCa 外周血cfNA 標記物，與傳統(tǒng)的血清PSA 和影像學(xué)手段結(jié)合使用以減少臨床誤診和漏診。血循環(huán)含有豐富的生物標志物種類可供重復(fù)取樣及聯(lián)合檢測、病情動態(tài)監(jiān)測，因此血液cfNA 在PCa 診斷方面具有廣闊的研究前景。但是如何將其應(yīng)用于臨床尚面臨諸多挑戰(zhàn)，如對cfNA 樣品采集儲存、分析研究手段、實驗設(shè)備條件等制定統(tǒng)一標準，以實現(xiàn)檢測標準化；許多研究存在樣本量太少的問題，需要進一步進行大規(guī)模、多中心的臨床前瞻性研究，構(gòu)建更有參考價值的大數(shù)據(jù)集合。此外，開發(fā)出更加快速、經(jīng)濟、精準可靠的檢測技術(shù)，增加醫(yī)生和患者的接受度，也是需要解決的問題。