安東,袁正偉

(1中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽110001；2中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院衛(wèi)生部小兒先天畸形重點實驗室)

蛋白質(zhì)組學是在大規(guī)模水平上對某一特定細胞、組織、體液中所有蛋白質(zhì)進行研究的學科?；蚪M學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學分別從基因、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物角度研究，共同構(gòu)成現(xiàn)代生物研究的重要手段，為生命科學的發(fā)展提供了廣闊前景[1]。差異蛋白質(zhì)組學是蛋白質(zhì)組學研究的主要策略之一，借助該技術(shù)可以篩選出不同因素引起的樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，同時獲得對某些關(guān)鍵蛋白的認識和功能分析。作為研究生命現(xiàn)象的手段和方法，差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)對發(fā)現(xiàn)疾病診斷標志物、研究疾病發(fā)病機制、尋找新的靶向治療藥物有重要的應用價值。神經(jīng)系統(tǒng)是人體非常復雜的器官系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)的疾病種類多樣，臨床表現(xiàn)各異，病因復雜，發(fā)病機理不清，診斷和治療都面臨巨大挑戰(zhàn)。差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)能從眾多復雜的基因和蛋白質(zhì)中篩選出一組改變明顯的關(guān)鍵性分子，找到疾病發(fā)生、發(fā)展的候選標志物?，F(xiàn)就差異蛋白質(zhì)組學研究的主要技術(shù)手段以及該技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域的差異蛋白質(zhì)組學分析研究綜述如下。

1 差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)

1.1 基于雙向凝膠電泳(2-DE)定量技術(shù) 傳統(tǒng)2-DE技術(shù)其原理是根據(jù)等電點和分子量兩個方面將蛋白質(zhì)進行分離。隨著技術(shù)進展，出現(xiàn)了熒光差異凝膠電泳(DIGE)。DIGE的技術(shù)原理是將熒光染色技術(shù)與雙向電泳技術(shù)相結(jié)合，首先對測試樣品用不同熒光染料標記，然后將混合樣品在同一塊凝膠上進行雙向電泳，使測試樣品的蛋白質(zhì)在同一平面顯示不同的熒光，從而區(qū)分蛋白質(zhì)點不同熒光的差異，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的相對定量。該方法與傳統(tǒng)的2-DE相比有助于完全二維分析和量化，克服了其重復性差的問題。但DIGE只適用于標記含有賴氨酸的蛋白，否則將使用特殊熒光染料，費用較為昂貴。

1.2 基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)定量技術(shù) 目前基于LC-MS/MS定量技術(shù)飛速發(fā)展，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學研究的主要分析手段，其靈敏度更高、檢測范圍更大，且檢測速度快、自動化程度高，可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)組學研究高通量、高深度的要求。其方法進一步分為兩種:非標記定量技術(shù)和穩(wěn)定同位素標記定量技術(shù)。

1.2.1 非標記定量技術(shù) 非標記定量通過比較樣品中蛋白質(zhì)酶解后多肽的質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強度進行定量分析。該技術(shù)包括兩種定量方法?；诙壸V圖的非標記定量技術(shù)利用蛋白肽段匹配的二級譜圖計數(shù)實現(xiàn)蛋白定量，基于一級質(zhì)譜的非標記定量是比較一級譜圖中的質(zhì)譜峰面積強度或離子信號強度進行相對定量。非標記定量所需樣品制備簡單、無需標記、試驗速度快、成本較低。近年來，基于一級質(zhì)譜的蛋白質(zhì)非標記定量技術(shù)隨著配套數(shù)據(jù)處理軟件和程序不斷開發(fā)，該技術(shù)得到了較廣泛的應用。但是在高豐度蛋白存在時,譜圖數(shù)可能達到飽和造成結(jié)果不準確，且只依據(jù)一級質(zhì)譜和數(shù)據(jù)模型定量，準確率不高，且重現(xiàn)性差[2]。

1.2.2 穩(wěn)定同位素標記定量技術(shù) 是向測試樣品中引入穩(wěn)定同位素標記，通過比較不同同位素標記物的質(zhì)譜信號強度實現(xiàn)不同樣品中蛋白質(zhì)的相對定量分析。穩(wěn)定同位素標記方法與相對非標記定量相比，定量更為準確，重復性好。根據(jù)同位素標記引入方式的不同，分為體內(nèi)標記和體外標記兩類。細胞培養(yǎng)中穩(wěn)定同位素標記氨基酸(SILAC)是經(jīng)典的體內(nèi)標記定量技術(shù)，其原理是利用輕、重同位素標記的必需氨基酸培養(yǎng)細胞，細胞經(jīng)過若干次傳代，細胞內(nèi)新合成蛋白質(zhì)被同位素穩(wěn)定標記，然后將樣品混合，根據(jù)兩種不同同位素標記肽段的面積或峰強度比實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的相對定量。SILAC技術(shù)可以把時間維度與定量蛋白質(zhì)組學相結(jié)合，從而對蛋白質(zhì)組動態(tài)變化進行研究。體外化學標記常用方法主要有基于一級質(zhì)譜的同位素親和標簽(ICAT)技術(shù)、基于串聯(lián)質(zhì)譜的等重同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)和串聯(lián)質(zhì)量標簽(TMT)技術(shù)等。ICAT技術(shù)通過特異性結(jié)合半胱氨酸琉基的ICAT試劑來標記肽段，而后進行分離純化和質(zhì)譜鑒定，根據(jù)一級質(zhì)譜圖中標記肽段的面積比實現(xiàn)相對豐度的定量。該技術(shù)可以簡便、快速、準確比較樣品中球蛋白的表達。基于串聯(lián)質(zhì)譜的iTRAQ標記技術(shù)是目前差異蛋白質(zhì)組學研究中應用最廣的技術(shù)，所采用的標本來源廣泛，可將腦組織、腦脊液、血漿、細胞、體液等各種樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶酶切為多肽后用iTRAQ標記，通過比較第二級質(zhì)譜中不同樣品的報告離子峰強度進行相對定量分析。具有靈敏度高、標記效率高、蛋白質(zhì)覆蓋率高，數(shù)據(jù)豐富，定量準確、可信度高、重復性好等優(yōu)點[3]。通過在樣本中加入已知量的經(jīng)iTRAQ標記的標準品做內(nèi)標，還可進行蛋白質(zhì)的絕對定量。基于iTRAQ技術(shù)的差異蛋白組學研究方法已成為發(fā)現(xiàn)疾病生物標志物的主要分析手段。TMT試劑與iTRAQ 試劑的原理類似，可以對2組、6組、10組樣品同時進行標記。目前TMT 試劑在蛋白質(zhì)組學研究中應用日趨增長，該定量技術(shù)還可以通過與高分辨質(zhì)譜技術(shù)和其他標記技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)更高通量、更深精度的蛋白質(zhì)組學定量分析[4]。

2 差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病生物標志物篩選中的應用

生物標志物作為機體在疾病狀態(tài)下的分子信號，可以呈現(xiàn)為體液中的循環(huán)物質(zhì)，也可以定位于細胞內(nèi)部，是診斷、監(jiān)測疾病、評估治療和判斷預后的重要標志。利用差異蛋白質(zhì)組學可以在組織或體液中進行定性、定量研究,高通量篩查出系列特異生物分子。這些生物標志物可以應用于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)缺血損傷、神經(jīng)發(fā)育畸形的診斷及治療。

2.1 神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤 確診中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤通常需要活檢，基于蛋白質(zhì)組學技術(shù)尋找血漿標志物作為一種非侵入性的診斷手段成為現(xiàn)今的研究熱點。目前對神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(如多形性膠質(zhì)細胞瘤、星形細胞瘤)蛋白和基因的表達已有很多研究。Miyauchi等[5]用SWATH 質(zhì)譜技術(shù)分析比較了膠質(zhì)瘤患者與正常人群血漿差異蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LRG1、C9、CRP、GSN、IGHA1、APOA4具有較好的診斷價值，并且發(fā)現(xiàn)LRG1、CRP、C9與腫瘤大小呈明顯正相關(guān)。Petushkova等[6]利用蛋白翻譯后修飾組學研究發(fā)現(xiàn)了膠質(zhì)母細胞瘤患者血漿乙?；头核鼗揎椀漠惓?。Polisetty等[7]應用高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析了彌漫性星形膠質(zhì)細胞瘤的差異膜蛋白組，與已報道的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對，發(fā)現(xiàn)190種差異蛋白在兩組不同組學數(shù)據(jù)中表達趨勢一致。在新近研究中，Spreafico等[8]用腦脊液蛋白質(zhì)組鑒定了兒童腦腫瘤擴散轉(zhuǎn)移的預測標記物，其中驗證了6種蛋白(1型膠原、胰島素樣結(jié)合蛋白4、前膠原 C-肽鏈內(nèi)切酶增強子1、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α2、胰蛋白酶α抑制劑重鏈4、神經(jīng)增殖和分化控制蛋白-1)在腫瘤轉(zhuǎn)移病例組與對照組有顯著差異。2017年Gu等[9]比較了來源于Ⅳ期髓母細胞瘤患兒的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤細胞系的差異蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 400種顯著變化的差異蛋白，這些差異蛋白包括一些已知的對腫瘤轉(zhuǎn)移有促進或抑制作用的蛋白，同時也發(fā)現(xiàn)了大量未知作用的蛋白，此為將來進一步研究髓母細胞瘤轉(zhuǎn)移標記物提供了線索。

2.2 神經(jīng)退行性疾病 神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率近年有明顯的上升趨勢，由于其發(fā)病機制尚不清楚，治療也缺乏有效方法和手段。由于腦脊液與腦組織中細胞外液直接相連，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變時，會影響腦脊液中的組成成分，因此檢測腦脊液蛋白質(zhì)組學對中樞神經(jīng)疾病的診斷、治療和預后判定具有重要意義。腦脊液蛋白質(zhì)組學的研究代表了對中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理及病理變化認識層次的深入。Abdi等[10]利用iTRAQ 標記技術(shù)通過腦脊液蛋白質(zhì)組學研究了神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病(AD)、帕金森病和路易體癡呆征患者腦脊液中蛋白質(zhì)表達的差異，檢測鑒定出1 500多種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了大量的差異蛋白，驗證結(jié)果顯示多種標志蛋白質(zhì)聯(lián)用可以提高診斷的特異性和敏感性。Sathe 等[11]應用高分辨質(zhì)譜及TMT標記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)發(fā)現(xiàn)了AD患者腦脊液中139種差異蛋白，其中NPTX2聯(lián)合PKM或YWHAG具有較好的診斷敏感性和特異性，這些差異蛋白質(zhì)有可能成為AD病情進展及治療的反應性監(jiān)測指標。

2.3 顱腦缺血損傷 顱腦損傷其病程進展及預后往往難以預測，對其進行準確的早期診斷面臨巨大的挑戰(zhàn)，且目前尚無有效的治療方法。鈣結(jié)合蛋白S100B蛋白最近被確定為腦損傷診斷及預后的標志物[12]。使用定量基于MS 蛋白質(zhì)組學方法，Hanrieder 等[13]發(fā)現(xiàn)重型顱腦損傷后急性期反應物水平升高，包括纖維蛋白原、神經(jīng)元特異烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和胱抑素C，而腦脊液中S100B 無變化。Bao等[14]收集重度腦損傷患者慢性意識障礙病程不同時間段及健康人群血漿，對血漿樣本進行iTRAQ 標記和分析，在顱腦損傷后鑒定出32種蛋白質(zhì)有顯著差異改變，并且這些差異蛋白主要參與補體系統(tǒng)通路。

2.4 神經(jīng)發(fā)育畸形 神經(jīng)管畸形(NTD)是兒童常見嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)先天畸形，發(fā)病率為1‰～5‰。該病由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用所致，其畸形的發(fā)病機制并不清楚，治療效果不佳。Fan[15]等用雙向電泳和質(zhì)譜分析的方法對先天性脊柱裂胎鼠的脊髓組織進行了蛋白質(zhì)表達譜的分析，鑒定出14種差異蛋白。Shan等[16]利用該方法結(jié)果在羊水中鑒定出7種差異蛋白質(zhì)。Liu等[17]利用表面增強激光解析/離子化飛行時間質(zhì)譜篩選神經(jīng)管缺陷胎兒母親血清、尿液和羊水中差異蛋白，并結(jié)合分類與回歸分析建立診斷模型，診斷神經(jīng)管缺陷胎兒的靈敏度和特異度較高。An等[18]用iTRAQ結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)比較了NTD及正常妊娠孕鼠血清中差異蛋白，分別在致畸早期2個時間點鑒定得到40種和26種差異表達蛋白質(zhì)，并且在孕婦血清中擴大樣本驗證PCSK9作為NTD產(chǎn)前診斷標志物具有較好的敏感性和特異性。Shen等[19]用MALDI-TOF-MS 技術(shù)比較了NTD妊娠與正常妊娠孕婦血清蛋白質(zhì)的差異表達，經(jīng)蛋白質(zhì)指紋圖譜軟件發(fā)現(xiàn)3種蛋白診斷NTD的敏感性和特異性可達到96%和90%。

3 未來展望

近年來，蛋白質(zhì)組學方法在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究領(lǐng)域取得了長足的發(fā)展，神經(jīng)系統(tǒng)疾病生物靶標的研究成為當今熱點。未來我們期待在疾病早期就可以發(fā)現(xiàn)用于臨床的以非侵入性檢查獲得的新的分子標志物，從而及早發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。非侵入的生物靶標主要在體液中尋找，如血漿、尿液和腦脊液等，而腦脊液和大腦直接接觸，因此腦脊液蛋白質(zhì)組學對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究有很大價值。然而由于體液中含有大量的高豐度蛋白，難以鑒定出低豐度蛋白，因此發(fā)展對低豐度蛋白的富集技術(shù)，以便鑒定出更多的有價值的分子標志物至關(guān)重要。而實現(xiàn)生物靶標的臨床應用還需要遵循蛋白質(zhì)組學臨床指南在多中心進行大樣本的生物驗證研究。