李乾鵬，冉學(xué)紅，朱旭，劉洋，盛志新，劉麗萍

(濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊261000)

急性髓系白血病(AML)是一組高度異質(zhì)性、源于白血病干細(xì)胞的惡性克隆性疾病群[1]。隨診療技術(shù)的提高，AML患者預(yù)后得到很大改善，但因AML易復(fù)發(fā)和耐藥，導(dǎo)致現(xiàn)階段治療失敗率較高[2]。對(duì)AML復(fù)發(fā)耐藥機(jī)制深入研究，有助于探索更有效的診療手段。果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)[3,4]具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，在多種惡性實(shí)體腫瘤(如卵巢癌、胃癌等)中高表達(dá)，且與預(yù)后不良相關(guān)[4～6]。新近報(bào)道顯示，血液系統(tǒng)惡性腫瘤中EZH2呈高表達(dá)，并且EZH2高表達(dá)多發(fā)生在高?；颊遊3]，提示EZH2參與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。張力蛋白同源的10號(hào)染色體缺失的磷酸酶基因(PTEN)是一種具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，位于10號(hào)染色體上[7]。PTEN可使PIP3去磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與存活[8]。PTEN在腫瘤組織中低表達(dá)，是某些腫瘤(如膀胱癌、胃癌等)診斷及預(yù)后的重要參考指標(biāo)。研究表明，PTEN表達(dá)或活性水平微量降低可導(dǎo)致腫瘤易感性增強(qiáng)[8]。另有報(bào)道顯示，PTEN表達(dá)缺失可促進(jìn)白血病干細(xì)胞產(chǎn)生[8,9]。由此可見，PTEN在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。為探討EZH2、PTEN在AML發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的EZH2、PTEN mRNA表達(dá)，并分析EZH2 mRNA與PTEN mRNA表達(dá)的相關(guān)性，為AML的診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞來源 選取濰坊市人民醫(yī)院血液科2014年3月～2015年3月收治的AML患者60例納入AML組，其中男29例、女31例，年齡16～82(47.24±7.91)歲。AML診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《血液診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)第3版》。另選擇因貧血、不明原因出血等行骨髓穿刺檢查者20例為正常對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。采集兩組研究對(duì)象的骨髓液5 mL，無菌條件下EDTA抗凝處理，加入紅細(xì)胞裂解液，室溫靜置10 min，1 300 r/min離心10 min，PBS洗滌2次，獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞。

1.2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞中EZH2、PTEN mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。用TRIzol提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞總RNA，檢測(cè)總RNA純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系參照Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒配置。反應(yīng)條件為94 ℃反應(yīng)5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)終止反應(yīng)；在PCR循環(huán)第二步60 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)，設(shè)空白對(duì)照。內(nèi)參β-actin上游引物序列為5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′，下游引物序列為5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3′；人EZH2基因上游引物序列為5′-GACCCTGACCTCTGTCTTACTT-3′，下游引物序列為5′-GATGGTGCCAGGCAATAGATG-3′。人PTEN上游引物序列為5′-CTATTCCCAGTCAGAGGCGCTAT-3′，下游引物序列為5′-TGAACTTGTCTATCCCGTCGTGT-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 AML組及正常對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中EZH2、PTEN mRNA表達(dá)比較 AML組及正常對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中EZH2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為284.8±15.9、100.0±7.2，AML組及正常對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為30.8±3.6、103.0±7.5。AML組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中EZH2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組，PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組(P均<0.01)。

2.2 AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中EZH2 mRNA、PTEN mRNA表達(dá)的相關(guān)性 AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中EZH2 mRNA與PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.694，P<0.05)。

3 討論

AML是嚴(yán)重威脅人類健康的造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病[1,10]。AML的發(fā)病率逐年增加，且5年生存率小于50%[2,10]?；熥鳛锳ML的主要治療手段，已取得較大進(jìn)展，但由于耐藥現(xiàn)象的存在，多數(shù)患者仍出現(xiàn)難治、復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致治療失敗[11]。表觀遺傳學(xué)變異在白血病的復(fù)發(fā)耐藥中具有重要作用。白血病細(xì)胞耐藥的主要機(jī)制包括DNA損傷修復(fù)異常、細(xì)胞周期紊亂、細(xì)胞凋亡逃逸、藥物代謝干擾、藥物靶點(diǎn)變異、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)障礙等。

EZH2基因位于染色體7q35，是PcG復(fù)合物的核心組成部分[12]。EZH2可三甲基化組蛋白H3的27位賴氨酸，發(fā)揮基因沉默的生物學(xué)效應(yīng)；亦可通過甲基化依賴的泛素化機(jī)制降解RORα，沉默相關(guān)基因[3]。另外，EZH2也有基因活化的作用，如通過與β-catenin、ERα相互作用，導(dǎo)致ERα/β-catenin/Wnt通路活化，通過與RelA/RelB相互作用激活NF-κB[13,14]。EZH2在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲、耐藥中發(fā)揮重要作用，主要機(jī)制包括miRNA沉默、腫瘤免疫逃逸、非經(jīng)典轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等[15]。在血液系統(tǒng)中，EZH2對(duì)維持造血干細(xì)胞的自我更新、分化有重要意義[13]。EZH2在AML、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤等惡性血液系統(tǒng)疾病中異常表達(dá)，且高表達(dá)EHZ2的患者預(yù)后差、易復(fù)發(fā)[16]。在血液系統(tǒng)疾病中，EZH2表現(xiàn)出雙重作用，如在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤中，EZH2存在功能獲得性突變；而在骨髓增生異常綜合征、骨髓增生異常綜合征/骨髓增殖性腫瘤、骨髓纖維化中，EZH2表現(xiàn)出功能缺失性突變[3]。

PTEN有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，其編碼的蛋白在胞質(zhì)中表現(xiàn)出雙重特異性磷酸酶活性，即蛋白酪氨酸磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性[8]。在分子遺傳學(xué)水平，PTEN通過調(diào)控重要的信號(hào)通路與細(xì)胞代謝過程影響細(xì)胞基因的穩(wěn)定性。在細(xì)胞水平，PTEN在干細(xì)胞的自我更新、細(xì)胞周期等方面具有重要作用[17]。在前列腺組織中，PTEN表達(dá)缺失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生；在胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，PTEN表達(dá)缺失可促進(jìn)干細(xì)胞的自我更新及加速細(xì)胞周期從G0期向G1期進(jìn)展[8]。在血液系統(tǒng)，PTEN缺失可導(dǎo)致正常造血干細(xì)胞過度增殖并演變?yōu)榘籽「杉?xì)胞[17,18]。白血病干細(xì)胞中PTEN表達(dá)缺失導(dǎo)致干細(xì)胞基因不穩(wěn)定，如β-catenin激活、Myc基因過表達(dá)等癌基因表達(dá)異常，上述癌基因異常表達(dá)又進(jìn)一步促進(jìn)白血病干細(xì)胞增殖，以此形成惡性反饋[8]。除此之外，PTEN缺失還可激活JAK2/STAT3通路及促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中免疫抑制因子的釋放，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[8]。因此，PTEN是一種重要的抑癌基因，其正常表達(dá)能夠抑制細(xì)胞過度增殖、促進(jìn)細(xì)胞生理性凋亡、減少DNA損傷并抑制腫瘤細(xì)胞的代謝[8]?！鞍顺亍敝蠵TEN表達(dá)水平對(duì)于維持細(xì)胞基因穩(wěn)定性至關(guān)重要；PTEN表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞基因的完整性受損[8,19]，出現(xiàn)原癌基因(如Myc)過表達(dá)及抑癌基因(如p53)低表達(dá)或缺失，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與復(fù)發(fā)耐藥。

本研究結(jié)果顯示，AML組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中EZH2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組，PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組；AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中EZH2 mRNA與PTEN mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這提示EZH2和PTEN與AML的發(fā)病有關(guān)，且二者之間可能存在一定的相互作用。我們推測(cè)，PTEN表達(dá)缺失可能是腫瘤發(fā)生的誘發(fā)因子。低水平的PTEN導(dǎo)致細(xì)胞中重要的癌基因EZH2穩(wěn)定性減低，導(dǎo)致EZH2過度表達(dá)，進(jìn)而參與AML的發(fā)病。我們先前研究發(fā)現(xiàn)促癌因子EVI1 mRNA在AML患者中高表達(dá)，PTEN mRNA在AML患者中低表達(dá)，二者亦呈負(fù)相關(guān)[20]，推測(cè)在AML中PTEN缺失導(dǎo)致癌基因EZH2與EVI1突變，二者過度表達(dá)，最終誘發(fā)AML的發(fā)生發(fā)展。在此過程中是否有其他基因參與仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。關(guān)于PTEN與EZH2、EVI1之間的相互作用及其機(jī)制也有待研究證實(shí)。