陳浩 洪體玉

摘要：利用氟喹諾酮類殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，測定豬尿中氟喹諾酮類藥物的殘留量。研究了豬尿樣品本底顏色，蛋白含量以及樣品離心對測定結(jié)果的影響，獲得豬尿樣品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測的前處理方法，并通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及豬尿樣品特異性實(shí)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了確定。

關(guān)鍵詞：氟喹諾酮類藥物;殘留;酶聯(lián)免疫;豬尿

氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，F(xiàn)QNS）藥物是近二十年來快速發(fā)展起來的一類高效抗菌藥。具有抗菌譜廣，高藥效，低毒性，穿透組織能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能有效抑制細(xì)菌DNA螺旋酶的合成^[1]，因此近年來在獸醫(yī)臨床診療和水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為一種不可多得的高效抗感染類藥物得到廣泛應(yīng)用。在大量用于預(yù)防、治療和促進(jìn)個(gè)體生長的同時(shí)，這類藥物的殘留問題也引起了國內(nèi)外有關(guān)方面的高度關(guān)注，其殘留的危害性除了對人類的直接毒副作用和潛在致癌作用外主要報(bào)道為該類藥物容易誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而不利于該類藥物對人類相關(guān)疾病的治療作用^[2]。在美國目前FQNS在食品動物中是禁止使用的，為保障食品安全，我國FQNS殘留也已經(jīng)列為動物性食品的一個(gè)重點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測項(xiàng)目，并制定了嚴(yán)格的相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。廣西檢驗(yàn)檢疫局按照國家質(zhì)檢總局的部署，針對供港澳活豬的獸藥殘留監(jiān)管做了大量卓有成效的工作，制定了詳細(xì)的工作方案，并將供港豬豬尿獸藥殘留作為日常監(jiān)測的主要內(nèi)容，其中FQNS是主要監(jiān)測項(xiàng)目之一。

目前，F(xiàn)QNS殘留主要的檢測方法有：微生物法、液相色譜法（LC）、高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）、免疫分析法、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）等^[3-5]。這些方法雖各有優(yōu)點(diǎn)，但也存在樣品前處理比較復(fù)雜，操作過程繁瑣，時(shí)間長，所需儀器要求高等不足，對于畜牧部門的大批量檢測并不適用，而間接競爭ELISA方法具有較高的靈敏度，較強(qiáng)的特異性，樣品測定前處理簡單，操作過程只需50分鐘，簡單快速，能最大程度減少工作量，適合大批量樣品的篩選，尤其便于基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。目前市場上銷售的氟喹諾酮類ELISA試劑盒主要針對組織樣本如雞肉、豬肉、魚、蝦等和牛奶、奶粉、雞蛋等，沒有明確標(biāo)示豬尿中氟喹諾酮類殘留的檢測。因此我們通過實(shí)驗(yàn)對豬尿樣品前處理的影響因素進(jìn)行了分析，得到了豬尿中氟喹諾酮類殘留的檢測方法。

1 ??材料和方法

1.1 ?材料與儀器

1.1.1 ?材料

豬尿（采自轄區(qū)內(nèi)養(yǎng)殖場）;氟喹諾酮類殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（北京勤邦生物技術(shù)有限公司）;氟喹諾酮類藥物、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、β興奮劑、紅霉素、林可霉素、沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品（RANDOX.公司）;其余試劑均采用國產(chǎn)分析純（AR）試劑。

1.1.2 ?實(shí)驗(yàn)儀器

Thermo Multiskan MK3 全自動酶標(biāo)儀，美國;貝克曼Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機(jī)，美國;VORTEX-GENIE2 漩渦混合器，美國;dragonlab移液器（10—100μL）;Finnpipette精密8道可調(diào)移液器（30—300μL）;日本三洋MIR-254低溫恒溫箱。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)方法：將所需試劑回溫至室溫（20—25℃），取出所需數(shù)量的微孔板，將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行。加樣：加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本50μL/孔到對應(yīng)的微孔中。隨即加抗體工作液和酶標(biāo)二抗?jié)饪s液的混合液50μL/孔到所有微孔中（將抗體工作液和酶標(biāo)二抗?jié)饪s液按10：1體積比混合，此混合液不能保存，混勻后立刻進(jìn)行加樣），用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境反應(yīng)30min。洗板：將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，充分洗滌4—5次，每次間隔10s，將板孔拍干。顯色：加入底物A液50μL/孔，再加入底物B液50μL/孔，混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min。測定：加入終止液50μL/孔，混勻，于雙波長450/630nm處測定每孔OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氟喹諾酮類藥物的實(shí)際濃度。

1.2.1 ?豬尿樣品本底顏色對測定結(jié)果的影響

取豬尿樣品兩份，一份直接測定，另一份樣品以相同體積純水代替顯色液底物液B液，其余按照相同步驟進(jìn)行測定。

1.2.2、豬尿中蛋白含量對測定結(jié)果的影響

取5份尿液，其中4份分別加入亞鐵氰化鉀（106g/L）+乙酸鋅溶液（220g/L）、磺基水楊酸（4%）溶液、三氯乙酸（5%）溶液、高氯酸溶液（5%）、無水乙醇沉淀樣品中的蛋白，混勻后靜置10min，離心，取上清液進(jìn)行測定，另一份樣品加入同體積純水代替蛋白沉淀劑同時(shí)進(jìn)行測定。每份尿液做四個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

1.2.3、豬尿樣品離心對測定結(jié)果的影響

取豬尿樣品兩份，一份樣品不進(jìn)行離心，另一份離心，其余按照相同步驟進(jìn)行測定。

1.2.4、加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取4份已知FQNS殘留含量的豬尿樣品，分別加入1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，按照相同步驟進(jìn)行測定。

1.2.5、豬尿樣品氟喹諾酮類殘留特異性實(shí)驗(yàn)

取8份豬尿樣品，分別加入氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、β興奮劑、紅霉素、林可霉素、沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，按照相同步驟進(jìn)行測定。

2 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1豬尿樣品本底顏色對測定結(jié)果的影響

通過在實(shí)驗(yàn)過程中以相同體積純水代替顯色液底物液B液，研究豬尿樣品本底顏色對測定結(jié)果的影響（如表1所示），結(jié)果表明豬尿本底顏色對檢測結(jié)果影響甚微。

2.1.2豬尿中蛋白含量對測定結(jié)果的影響

通過在豬尿前處理環(huán)節(jié)中添加不同的蛋白沉淀劑，研究豬尿樣品中蛋白對測定結(jié)果的影響（如表2所示），結(jié)果表明加入蛋白沉淀劑均會不同程度影響樣品含量，其中加入無水乙醇對結(jié)果影響較大，加入沉淀劑高氯酸溶液、三氯乙酸溶液對結(jié)果影響較小。

2.1.3豬尿樣品離心對測定結(jié)果的影響

通過在豬尿前處理環(huán)節(jié)中對樣品進(jìn)行離心預(yù)處理，研究豬尿樣品離心對測定結(jié)果的影響（如表3所示），結(jié)果表明，作離心處理樣品結(jié)果比不作離心處理精密度更好。

2.1.4加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在已知豬尿中FQNS殘留含量的樣品中加入不同濃度FQNS標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算檢測回收率，結(jié)果如表4所示。

2.1.5 FQNS殘留在豬尿樣品中的特異性實(shí)驗(yàn)

通過在已知FQNS殘留含量（1.6ng/mL）的豬尿樣品中加入一定濃度的氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、β興奮劑、紅霉素、林可霉素、沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，研究FQNS殘留在豬尿樣品中的特異性，結(jié)果如表5所示。

3 ?討論

3.1豬尿樣品本底顏色對測定的影響

在檢驗(yàn)檢疫日常的監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，采集自不同豬場的不同豬尿樣品其顏色深淺不一，大體是黃色至棕黃色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不添加顯色劑的豬尿樣品盡管其本底顏色較深，經(jīng)測定扣除樣品本底顏色結(jié)果和不扣除樣品本底顏色結(jié)果基本一致，可見樣品本底顏色對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小，在樣品前處理的過程中無需采取除色處理等步驟，減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和步驟。

3.2蛋白質(zhì)沉淀常用的方法有鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、生物堿試劑與某些酸（如三氯醋酸）沉淀，重金屬鹽沉淀等。豬尿是一種生理體液，含有氨基酸及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，我們通過添加亞鐵氰化鉀+乙酸鋅溶液、磺基水楊酸溶液、三氯乙酸溶液、高氯酸溶液、無水乙醇處理豬尿中的蛋白質(zhì)，通過空白對照，我們發(fā)現(xiàn)，樣品前處理中加入蛋白沉淀劑均會不同程度影響樣品含量，其中加入無水乙醇對結(jié)果影響較大，可能與FQNS在無水乙醇的溶解性有關(guān)，而加入高氯酸溶液、三氯乙酸溶液影響較小。

3.3豬尿樣品離心對測定的影響

實(shí)驗(yàn)所添加豬尿樣品無肉眼可見懸浮物、沉淀物，結(jié)果表明作離心處理豬尿與不經(jīng)過離心處理尿液結(jié)果相比，結(jié)果基本一致，作離心處理豬尿樣品結(jié)果精密度稍高。一般豬尿樣品久置后經(jīng)微生物分解豬尿釋放含氮或含硫等有機(jī)成分氣體物質(zhì)，如氨氣、硫化氫、硫醇、糞臭素等，在相互作用下產(chǎn)生尿酸鹽等沉積，形成懸浮物和沉淀，這將會影響我們?nèi)拥臏?zhǔn)確，因此我們建議如果發(fā)現(xiàn)尿液有懸浮物及沉淀，在檢測之前應(yīng)進(jìn)行離心處理，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。

3.4加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

通過在已知豬尿FQNS殘留含量的樣品中加入FQNS標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)現(xiàn)在加標(biāo)量1—4ng/mL時(shí)，回收率隨添加濃度增加而升高，其回收率在73%—125%之間，平均回收率達(dá)到104%，操作中宜使樣品濃度范圍在2—3ng/mL之間，結(jié)果較為準(zhǔn)確。

3.5通過在已知FQNS殘留含量的豬尿樣品中加入一定濃度的氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、β興奮劑、紅霉素、林可霉素、克倫特羅、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，研究FQNS殘留在豬尿樣品中的特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、β興奮劑、紅霉素、林可霉素、克倫特羅、萊克多巴胺等標(biāo)準(zhǔn)品基本不反應(yīng)，特異性滿足實(shí)驗(yàn)要求。而沙丁胺醇存在一定交叉反應(yīng)，這也體現(xiàn)了試劑盒的局限性，故FQNS殘留確證還需配合HPLC等方法。

4 ?小結(jié)

開展供港活豬等農(nóng)產(chǎn)品的獸藥殘留安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控工作，不僅是產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)管理的重要基礎(chǔ)和質(zhì)量把關(guān)的主要手段，更是一項(xiàng)重大的政治任務(wù)，是關(guān)系到國家穩(wěn)定，人民健康以及經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的大問題。因此，掌握研究供港活豬獸藥殘留的現(xiàn)狀，不僅對發(fā)展壯大轄區(qū)供港澳活豬養(yǎng)殖企業(yè)意義重大，而且能為檢驗(yàn)檢疫部門的進(jìn)出口檢疫與常規(guī)監(jiān)管提供可靠參考。

動物服用藥物以后其原形藥物和代謝物主要以尿液的形式排泄?？赏ㄟ^檢測豬尿中氟喹諾酮類藥物殘留掌握該類藥物在豬個(gè)體和養(yǎng)殖場的使用情況^[6]。我們通過研究豬尿樣品本底顏色，蛋白含量以及樣品離心對測定結(jié)果的影響，獲得豬尿樣品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測的前處理方法為：豬尿本底顏色對結(jié)果影響較小，如果發(fā)現(xiàn)尿液有懸浮物及沉淀，建議在檢測之前應(yīng)進(jìn)行離心處理，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。并通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及豬尿樣品特異性試驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了確定。

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作者簡介：陳浩（1988.4-），男，漢族，廣西南寧人，本科，助理工程師，主要從事微生物及理化檢測。

洪體玉（1983），男，漢族，廣西南寧人，研究生，工程師，主要從事微生物及理化檢測。