張 雯，馬臣杰，李 武，曾 瑾，鄧光存①，吳曉玲②

(1.西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

寧夏回族自治區(qū)地處我國(guó)西北內(nèi)陸農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)，是農(nóng)業(yè)部“全國(guó)奶牛優(yōu)勢(shì)區(qū)域布局規(guī)劃”的重點(diǎn)區(qū)域[1]。截至2016年底，寧夏奶牛存欄量已達(dá)57.6萬頭，每年奶牛養(yǎng)殖業(yè)排放的糞污高達(dá)350萬t[2]，大量糞污堆積已經(jīng)成為威脅健康養(yǎng)殖和公共衛(wèi)生安全的重大隱患之一。已有研究表明，奶牛糞便中的有機(jī)物、重金屬元素可溶于廢水或雨水，并隨之滲入土壤污染地下水[3]；同時(shí)奶牛糞便會(huì)產(chǎn)生大量含甲烷、氨、硫化物等有害物質(zhì)的氣體，污染周邊空氣，對(duì)人和奶牛的呼吸道造成危害[4]；更嚴(yán)重的是奶牛糞便攜帶的多種寄生蟲和病原菌會(huì)對(duì)人和奶牛的健康造成威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，由動(dòng)物傳染給人的疾病有90余種[5]，包括細(xì)菌感染所導(dǎo)致的疾病[6-7]。SINTON等[8]發(fā)現(xiàn)一些食品中病原菌的污染與畜禽排泄物有關(guān)，這些病原菌通過糞便還田施入土壤，可在環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間存活，并通過種植的作物最終影響到人類健康[9]。如果對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)糞污不采取有效處理措施，糞污將會(huì)對(duì)水、土、氣等造成嚴(yán)重生物性污染，對(duì)人類和生態(tài)環(huán)境造成極大危害[10]。因此，深入研究奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)糞便可培養(yǎng)細(xì)菌種類及多樣性可為奶牛糞便無害化處理和資源化利用提供重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

寧夏回族自治區(qū)目前對(duì)奶牛糞便的利用途徑主要有兩種：一是作為有機(jī)肥料；二是晾干后返回養(yǎng)殖場(chǎng)做為場(chǎng)區(qū)墊料。這兩種處理方式都沒有經(jīng)過相應(yīng)的無害化處理，且由于缺少對(duì)研究區(qū)奶牛糞便中細(xì)菌種群分布及耐藥性的相關(guān)研究，導(dǎo)致無法對(duì)這兩種糞便利用方式進(jìn)行有效、準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。因此，采用梅里埃全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)和16S rDNA全長(zhǎng)測(cè)序方法對(duì)銀川地區(qū)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)糞污及周邊土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌種群分布及多樣性進(jìn)行系統(tǒng)研究，為奶牛養(yǎng)殖業(yè)對(duì)環(huán)境及公共衛(wèi)生安全影響的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供有效數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采自寧夏回族自治區(qū)銀川市3家規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)，包括108份新鮮糞便(牛體排出還帶有體溫的新鮮糞便)、81份堆積糞便(堆積3個(gè)月以上的糞便及墊料混合物)、68份土壤(養(yǎng)殖場(chǎng)周邊未接觸糞便的環(huán)境土壤)和18份污水(沖洗牛體及圈舍的排放水)，共275份。樣品采集之后裝入自封袋中并編號(hào)，保存于冰盒，在4 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室后立即將樣品混勻、稀釋并涂布接種。

1.2 主要試劑與儀器

伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、蠟樣芽孢桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基和TODD-HEWITT BROTH培養(yǎng)基均購(gòu)于英國(guó)OXCID公司，血瓊脂平板培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋生物科技有限公司，全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)(VITEK?2 Compact)、比濁儀(DensiCHEK plus)以及VITEK2革蘭氏陰性(21341)、VITEK2革蘭氏陽(yáng)性(21342)和BCL芽孢細(xì)菌鑒定卡(21345)均來自法國(guó)生物梅里埃公司，高壓滅菌鍋來自德國(guó)AUTOCLAVE有限公司；生物光學(xué)顯微鏡購(gòu)于北京普瑞賽司儀器有限公司。

1.3 樣品懸液的制備

將采集的新鮮糞便樣品以至少6個(gè)為1組進(jìn)行混樣，其他3種樣品(堆積糞便、土壤和污水)根據(jù)每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采樣數(shù)量以至少3個(gè)為1組進(jìn)行混樣?；鞓訒r(shí)每份樣品稱取5.0 g，取混合后的樣品5.0 g加入45 mL無菌生理鹽水制成10-1梯度稀釋液，置于漩渦振蕩儀上振蕩(800 r·min-1，1 min)混勻，取1 mL懸液與無菌生理鹽水倍比稀釋制成10-2和10-3梯度稀釋液。

1.4 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離及純化

取100 μL的10-3梯度稀釋液，用無菌涂布棒均勻涂布于培養(yǎng)基上。涂布后將平板倒置于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄菌落特征及數(shù)量，并采用平板劃線法，對(duì)分離到的菌株進(jìn)行純化，每株細(xì)菌純化3～4代，得到純分離株。

1.5 分離株的鑒定

通過對(duì)不同分離培養(yǎng)基的初培養(yǎng)菌落形態(tài)進(jìn)行鑒定[11]，初步確定細(xì)菌種類(表1)。采用平板劃線法，挑取新鮮單個(gè)菌落接種于胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，選取生長(zhǎng)良好、性狀穩(wěn)定的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色并鏡檢(萊卡顯微系統(tǒng) DM2500，100X oil)。對(duì)于鏡檢時(shí)形態(tài)一致、革蘭染色結(jié)果明確的分離株使用相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)卡并采用全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)進(jìn)行鑒定；對(duì)革蘭染色鏡檢結(jié)果不明確和全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)未鑒定出的菌株選取符合測(cè)序要求的進(jìn)行16S rDNA全長(zhǎng)測(cè)序，通過對(duì)測(cè)序結(jié)果的BLAST序列進(jìn)行比對(duì)，獲得其種屬信息。16S rDNA全長(zhǎng)測(cè)序、拼接由廣州賽哲生物科技股份有限公司完成。

表1鑒別培養(yǎng)基用途及典型菌落特征

Table1Differentialmediauseandtypicalcolonycharacteristics

培養(yǎng)基類型 用途 典型菌株 菌落特征伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基分離腸道致病菌,特別大腸埃希菌有金屬光澤,黑色菌落是大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌無光澤,粉紅色菌落金黃色葡萄球菌抑制鼠傷寒沙門菌無色菌落麥康凱瓊脂培養(yǎng)基腸道致病菌選擇性分離大腸埃希菌桃紅色菌落,周圍有膽酸鹽沉淀環(huán)培養(yǎng)鼠傷寒沙門菌無色半透明菌落金黃色葡萄球菌抑制或部分抑制福氏志賀菌無色半透明菌落糞腸球菌抑制甘露醇氯化鈉瓊脂培金黃色葡萄球菌選擇性金黃色葡萄球菌黃色菌落,周圍有黃色環(huán)養(yǎng)基分離培養(yǎng)大腸埃希菌抑制蠟樣芽孢桿菌選擇性蠟樣芽孢桿菌選擇性分蠟樣芽孢桿菌菌落為微粉紅色,周圍有淡紅色沉淀環(huán)瓊脂培養(yǎng)基離培養(yǎng)大腸埃希菌抑制枯草芽孢桿菌黃色菌落,無沉淀環(huán)SS瓊脂培養(yǎng)基沙門菌、志賀菌選腸炎沙門菌黑色中心菌落擇性分離培養(yǎng)福氏志賀菌無色菌落,無黑心鼠傷寒沙門菌黑色中心菌落大腸埃希菌桃紅色菌落金黃色葡萄球菌抑制TODD-HEWITT BROTH鏈球菌選擇性分離培養(yǎng)溶血性鏈球菌白色小菌落培養(yǎng)基糞鏈球菌白色小菌落金黃色葡萄球菌乳白色大菌落化膿性鏈球菌白色小菌落血瓊脂平板培養(yǎng)基觀察溶血反應(yīng)甲型溶血性鏈球菌α溶血:又稱草綠色溶血,菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)1^2 mm的草綠色環(huán)乙型溶血性鏈球菌β溶血:菌落周圍形成寬大(2^4 mm)、界限分明、完全透明的溶血環(huán)

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)可培養(yǎng)細(xì)菌分離及鑒定

通過對(duì)收集樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，共獲得429株分離株，對(duì)其中383株鏡檢時(shí)形態(tài)一致、革蘭染色結(jié)果明確的分離株使用相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)卡進(jìn)行鑒定，263株菌株可以確定種屬，鑒定率為68.67%；120株無鑒定結(jié)果，占鑒定菌株的31.33%。對(duì)符合測(cè)序要求的102株菌株進(jìn)行16S rDNA全長(zhǎng)測(cè)序，鑒定出其中95株。兩種方法共鑒定358株細(xì)菌分離株(表2)，表明銀川地區(qū)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)新鮮糞便、堆積糞便、污水和環(huán)境土壤樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌種類較豐富。

2.2 奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)可培養(yǎng)細(xì)菌種群分布多樣性分析

可培養(yǎng)細(xì)菌種群多樣性分析結(jié)果表明，358株分離株分布于4個(gè)門、6個(gè)綱、15個(gè)目、23個(gè)科、39個(gè)屬和102個(gè)種，4種樣品在科以上水平上分布差異較小，而在屬、種水平上4種樣品的細(xì)菌種群分布差異較大(表3)。

表2養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境分離株鑒定情況

Table2Farmsenvironmentalisolatesidentified

樣品種類分離株數(shù)量鑒定株數(shù)量全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)16S rDNA測(cè)序合計(jì)鑒定率/%新鮮糞便1661124215492.77堆積糞便8444186273.81土壤9661228386.46污水8346135971.08合計(jì)4292639535883.45

表3養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境分離株種群分布多樣性

Table3Diversityofisolatesindairyfarms′samples

樣品種類門綱目科屬種 新鮮糞便3510162451 堆積糞便469152034土壤458131844污水348132037

4種樣品在不同水平上的Venn圖見圖1。

F表示新鮮糞便樣品；M表示堆積糞便樣品；S表示土壤樣品；W表示污水樣品。圖1 4種樣品在不同分類水平上的Venn圖

由圖1可知，在科分類水平上，氣球菌科(Aerococcaceae)和消化球菌科(Peptococcaceae)為新鮮糞便與堆積糞便樣品的共有科，慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)為堆積糞便與土壤樣品的共有科；假單胞菌科(Pseudomonadaceae)為土壤與污水樣品的共有科。在屬分類水平上，氣球菌屬(Aerococcusspp.)、孿生菌屬(Gemellaspp.)、差異球菌屬(Alloiococcusspp.)、變形桿菌屬(Proteusspp.)出現(xiàn)在新鮮糞便與堆積糞便樣品中；慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)和東海菌屬(Donghaeanaspp.)為堆積糞便與土壤樣品的共有屬；假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)為土壤與污水樣品的共有屬。進(jìn)一步在種分類水平上分析，嗜根考克菌(Kocuriarhizophila)、淺綠氣球菌(Aerococcusviridans)、嗜艾氏桿菌(Bacilluseiseniae)、耳炎差異球菌(Alloiococcusotitis)和大腸埃希菌O157：H7(EscherichiacoliO157:H7)分離自新鮮糞便和堆積糞便樣品中；溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningosepticum)為堆積糞便與土壤樣品的共有種；腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、芽孢桿菌(Bacillusoceanisediminis)、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)為土壤與污水樣品的共有種；在新鮮糞便與土壤樣品中，分離出海氏腸球菌(Enterococcushirae)、苛養(yǎng)顆粒鏈菌(Granulicatellaelegans)、人葡萄球菌(Staphylococcushominisssp.hominis)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)等8種共有種。4種樣品在各分類階元均分離出同種屬的分離株，表明樣品中細(xì)菌種群分布具有相似性。

新鮮糞便與堆積糞便樣品共有菌種數(shù)量在各分類階元中均高于新鮮糞便與土壤樣品或與污水樣品，說明堆積糞便保留了大部分來自新鮮糞便的群落，同時(shí)還受土壤細(xì)菌種群的影響，使兩者群落結(jié)構(gòu)具有相似性；污水樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌種群分布與新鮮糞便、堆積糞便和土壤樣品都存在較高的相似性，這主要是由于污水的流動(dòng)性導(dǎo)致大量細(xì)菌富集所致。通過對(duì)4種樣品細(xì)菌分離株在不同分類階元中分布的差異分析，表明各樣本具有豐富的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)。由于受到人為或自然的影響，細(xì)菌會(huì)在環(huán)境中發(fā)生遷移，增加了不同環(huán)境樣本的種群多樣性，同時(shí)也增加了病原菌的傳播風(fēng)險(xiǎn)。

樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌組成和相對(duì)豐度見圖2。由圖2可知，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)是優(yōu)勢(shì)微生物門，覆蓋了90%以上的菌種；微球菌科(Micrococcaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)8個(gè)科是優(yōu)勢(shì)科，占總類群的84.40%；考克菌屬(Kocuriaspp.)、腸球菌屬(Enterococcusspp.)、鏈球菌屬(Streptococcusspp.)、德庫(kù)菌屬(Desemziaspp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)、芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonasspp.)和泛菌屬(Pantoeaspp.)為優(yōu)勢(shì)屬，占總類群的66.30%。隨分類階元的降低，樣本間共有菌屬的相對(duì)豐度降低，而細(xì)菌群落多樣性增加。

由圖3可知，不同樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群組成較一致，葡萄球菌屬作為4種樣品的共同優(yōu)勢(shì)菌屬，分別占新鮮糞便、堆積糞便、土壤和污水樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌種類的30.97%、30.65%、28.92%和11.86%；其次是芽孢桿菌屬，分別占15.48%、16.13%、12.05%和5.08%。但是由于樣品自身的特性，群落組成也表現(xiàn)出明顯差異。例如，在污水樣品中，考克菌屬所占比例和葡萄球菌屬相同，為11.86%，但在其他3種樣品中考克菌屬所占比例遠(yuǎn)低于葡萄球菌屬。部分細(xì)菌種群是各樣品所獨(dú)有的，例如新鮮糞便樣品中獨(dú)有加德納菌屬(Gardnerellaspp.)0.65%、新生微球菌屬(Newbornmicrococcusspp.)0.65%、棒桿菌屬(Corynebacteriumspp.)0.65%、動(dòng)性球菌屬(Planococcusspp.)0.65%、玫瑰單胞菌屬(Roseomonasspp.)0.65%和布丘菌屬(Buttiauxellaspp.)0.65%；堆積糞便樣品中獨(dú)有短芽孢桿菌屬(Brevibacillusspp.)1.61%和弧菌屬(Vibriospp.)1.61%；土壤樣品中獨(dú)有微球菌屬(Micrococcusspp.)1.20%、肉桿菌屬(Carnobacteriumspp.)1.20%和海洋假單胞菌屬(Marinepseudomonasspp.)2.41%；污水樣品中獨(dú)有庫(kù)特菌屬(Kurthiaspp.)1.69%、克雷伯菌屬(Klebsiellaspp.)3.39%、預(yù)研菌屬(Yokenellaspp.)1.69%、氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)8.47%和希瓦菌屬(Shewanellaspp.)5.08%。這種差異不僅展示了各種樣品的獨(dú)特性，也說明糞便堆積過程會(huì)使一些細(xì)菌種群豐度增加，并且在堆積過程中，細(xì)菌會(huì)與周圍環(huán)境發(fā)生遷移，增加細(xì)菌性疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

F表示新鮮糞便樣品；M表示堆積糞便樣品；S表示土壤樣品；W表示污水樣品。圖2 奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)可培養(yǎng)細(xì)菌在門、科和屬水平上的組成和相對(duì)豐度

圖3 樣品中可培養(yǎng)微生物在綱、屬水平的分布

2.3 奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)可培養(yǎng)細(xì)菌中條件致病菌分布

健康的人或動(dòng)物體表及與外界相通的腔道等部位存在多種細(xì)菌種群，當(dāng)機(jī)體免疫力處于正常狀態(tài)時(shí)，這些菌群對(duì)機(jī)體無害甚至是有益的；但是當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，這些細(xì)菌可能侵入機(jī)體其他部位從而引起感染，這類細(xì)菌稱為條件致病菌(機(jī)會(huì)致病菌)[12]?；凇兑欢悇?dòng)物疫病釋義》[13]和《動(dòng)物病原微生物分類名錄》(原農(nóng)業(yè)部第53號(hào)令)對(duì)條件致病菌的定義及歸類，對(duì)4種樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌分離株進(jìn)行比對(duì)分析，部分結(jié)果見表4。在358株分離株中，條件致病菌約占88.55%(317/358)，在種水平上主要為[14-15]金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸埃希菌[16]，在屬水平上主要為鏈球菌屬、腸球菌屬、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacterspp.)、假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)和鞘脂單胞菌屬等。在新鮮糞便樣品中金黃色葡萄球菌占4.84%，大腸埃希菌占6.54%；在堆積糞便樣品中金黃色葡萄球菌占2.58%，大腸埃希菌占16.77%，炭疽桿菌(Bacillusanthracis)占1.61%；在土壤樣品中金黃色葡萄球菌占3.61%；在污水樣品中大腸埃希菌占5.08%。這表明奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)糞污中含有大量條件致病菌，這些條件致病菌將對(duì)人和動(dòng)物的健康以及對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重威脅[17]，是人類公共衛(wèi)生安全的潛在風(fēng)險(xiǎn)源。

表4奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境樣品中部分條件致病菌種屬信息

Table4Conditionalpathogenicbacteriainenvironmentalsamplesofdairyfarms

分類階元 病原菌革蘭陰陽(yáng)性疾病F/M/S/W樣品數(shù)量/株 種水平金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Gram +葡萄球菌病4/3/3/0炭疽桿菌(Bacillus anthracis)Gram +炭疽病0/1/0/0大腸桿菌(包括O157:H7)[Escherichia coli(include O157:H7)]Gram -溶血性尿毒癥綜合征、血栓性血小板減少性紫癜、出血性結(jié)腸炎26/4/0/3 屬水平不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter spp.)Gram -皮膚和傷口感染、菌血癥、腦膜炎、腸胃炎2/0/4/5鏈球菌屬(Streptococcus spp.)Gram +紅眼病、腦膜炎、細(xì)菌性肺炎、心內(nèi)膜炎、紅斑、壞死性筋膜炎4/3/2/2鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas spp.)Gram -呼吸道感染、臨床感染2/1/10/3腸球菌屬(Enterococcus spp.)Gram +尿路感染、菌血癥、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、憩室炎和腦膜炎17/3/3/4假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)Gram -皮膚和皮下組織感染、呼吸道感染、尿道感染、影響免疫系統(tǒng)受損的患者0/0/8/3

Gram -為革蘭陰性菌；Gram +為革蘭陽(yáng)性菌。F表示新鮮糞便樣品；M表示堆積糞便樣品；S表示土壤樣品；W表示污水樣品。

3 討論

規(guī)模化養(yǎng)殖是目前奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方式之一，而養(yǎng)殖場(chǎng)中可培養(yǎng)細(xì)菌種群直接影響著奶牛養(yǎng)殖業(yè)能否健康有序發(fā)展。因此，養(yǎng)殖場(chǎng)中可培養(yǎng)細(xì)菌種群分布及多樣性一直是廣受關(guān)注的熱點(diǎn)問題。目前有關(guān)奶牛腸道微生物研究較多[18]，但是針對(duì)奶牛糞便及奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境土壤及糞污中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的研究卻鮮有報(bào)道。基于細(xì)菌種屬間典型生理生化反應(yīng)譜差異和16s rDNA序列多態(tài)性，采用全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)和16S rRNA測(cè)序方法[19-22]，共鑒定了358株分離株，分布于4個(gè)門、6個(gè)綱、15個(gè)目、23個(gè)科、39個(gè)屬和102個(gè)種，表明銀川地區(qū)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)的糞污及土壤樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌種群豐富且多樣，其中條件致病菌占88.55%(317/358)，表明奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)糞污是潛在的病原菌傳播源[23]。

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)是奶牛糞便、污水和環(huán)境土壤樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門，占分離株總數(shù)的近90%，這與相關(guān)研究結(jié)果[24-25]一致。其中，堆積糞便樣品的細(xì)菌種群組成與新鮮糞便相似，但是考克菌屬(Kocuriaspp.)、鏈球菌屬(Streptococcusspp.)、德庫(kù)菌屬(Desemziaspp.)、芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonasspp.)在堆積糞便中的分離株數(shù)量比新鮮糞便多，其中包括部分條件致病菌，表明堆積的奶牛糞便有利于細(xì)菌，包括條件致病菌的富集或繁殖。污水樣品中分離株數(shù)量雖然最低，但其分離株中98.31%(58/59)為條件致病菌。因此，污水隨意排放造成的安全隱患不容忽視。相對(duì)于新鮮糞便和堆積糞便，土壤樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌種群多樣性較高，擁有較多樣化的種群結(jié)構(gòu)，但部分種屬在3者間均有分布，包括克氏庫(kù)克菌(Kocuriakristinae)、托爾豪特鏈球菌(Streptococcusthoraltensis)、小牛葡萄球菌(Staphylococcusvitulinus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)和少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)等，說明養(yǎng)殖場(chǎng)周邊環(huán)境土壤的可培養(yǎng)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)會(huì)受到糞污中細(xì)菌的影響。這表明細(xì)菌可在動(dòng)物機(jī)體(新鮮糞便)、養(yǎng)殖場(chǎng)糞污(堆積糞便和污水)和養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境(土壤)間進(jìn)行遷移[26-27]，甚至可能會(huì)遷移到水和空氣環(huán)境中[28-29]，更為嚴(yán)重的是這些細(xì)菌所攜帶的耐藥基因也會(huì)隨之在環(huán)境中傳播[30-31]。由此可見，如果養(yǎng)殖場(chǎng)糞污不經(jīng)有效處理就排放到環(huán)境中，將會(huì)增加細(xì)菌性傳染病發(fā)生的概率從而嚴(yán)重威脅人與動(dòng)物的健康。

對(duì)樣品中分離的條件致病菌數(shù)量及種類分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)過程中分離出的病原菌，多是各地區(qū)報(bào)道過的與奶牛乳房炎相關(guān)的病原菌，如大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等[32-34]。有研究表明，牛奶中病原菌的主要來源與擠奶過程中奶牛糞便的污染直接相關(guān)[35]。因此如果奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)糞污不經(jīng)科學(xué)處理就直接排放或還田，將會(huì)對(duì)奶牛健康養(yǎng)殖造成影響，進(jìn)而造成食源性污染，大大增加細(xì)菌性傳染病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，威脅人類健康[36-37]。系統(tǒng)研究奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)糞污細(xì)菌群落分布及多樣性，將會(huì)為奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康有序發(fā)展提供理論依據(jù)。