屠葉平 侯月梅 金曉媛 歐陽松 張曉雅

(1上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院老年科，上海 201499;2南方醫(yī)科大學(xué))

心房顫動(dòng)(房顫)是最常見的心律失常之一，其發(fā)生率隨年齡的增長(zhǎng)不斷增加。房顫嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量，是持續(xù)增長(zhǎng)的巨大的社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)〔1〕。盡管隨著醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，房顫治療手段也取得較大進(jìn)步，如射頻消融術(shù)、植入式自動(dòng)復(fù)律除顫器等，但藥物仍然是治療房顫的首選〔2〕。傳統(tǒng)的抗房顫藥物在使用時(shí)常引起其他類型心律失常的發(fā)生。因此，研發(fā)更安全有效的抗房顫藥物仍是熱點(diǎn)。苦參堿是從豆科植物苦參中提制而成。近年來，臨床上采用苦參制劑治療快速性心律失常取得了一定療效；在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，也已初步闡明苦參堿有抗心律失常的作用〔3，4〕。但目前為止，鮮見有將苦參堿直接用于抗房顫的基礎(chǔ)研究。微電極陣(MEA)是一種出色的基于生物電生理信號(hào)分析的藥物研發(fā)檢測(cè)工具〔5〕。本文應(yīng)用MEA技術(shù)，在慢性房顫兔模型中，探討苦參堿可能具有的抗房顫作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 60只成年新西蘭大白兔，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，不拘雌雄，體重3～4 kg，隨機(jī)分成對(duì)照組、起搏組、苦參堿A組(5 mg/kg)、苦參堿B組(10 mg/kg)、苦參堿C組(20 mg/kg)，苦參堿D組(40 mg/kg)，每組10只。

1.2主要試劑、設(shè)備、儀器 20%烏拉坦溶液，慶大霉素注射液(批號(hào)：140237)，苦參堿(批號(hào)：1031546)。自制實(shí)驗(yàn)用高頻心臟起搏器，鋼絲電極，德國(guó)產(chǎn)光電心電圖機(jī)，LEAD-7000電生理儀(四川錦江電子科技)，SA430動(dòng)物用人工呼吸機(jī)(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)。64位點(diǎn)EMA系統(tǒng)(德國(guó)MCS Gmbh公司)，主要配置為柔性電極(MEA1、MEA2)、MC-Rack軟件包、USB-ME64轉(zhuǎn)換卡、PGA64 放大器等。

1.3慢性房顫兔模型建立 采用高頻左心房起搏法制作慢性房顫兔模型〔6〕。使用20%烏拉坦按5 ml/kg劑量經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉，修剪胸腹部毛發(fā)，將兔仰臥位固定在操作臺(tái)上，沿胸骨中線開胸，暴露心臟，起搏電極頭端和尾端分別固定于左心房游離壁與胸腹壁，起搏器放置固定于腹壁上，連接各電極線。逐層縫合切口，術(shù)后靜脈注射慶大霉素8萬單位預(yù)防感染。起搏器模式為AOO，頻率1 000 min-1，電壓6 V，脈寬1.0 ms。起搏組連續(xù)刺激3 w；對(duì)照組只埋入起搏器，不行高頻左心房起搏。

1.4MEA系統(tǒng)及電信號(hào)采集 采用具有64位點(diǎn)的新一代MEA系統(tǒng)，配置的柔性電極包括MEA1和MEA2。原理：柔性電極記錄的原始電信號(hào)，通過放大器PGA64增益100倍后，由模數(shù)轉(zhuǎn)換卡USB-ME64數(shù)字化，最后使用軟件MC-Rack處理〔7〕。場(chǎng)電位參數(shù)：FPmin：第一個(gè)負(fù)向波峰值，F(xiàn)Pmax：最后一個(gè)正向波峰值，場(chǎng)電位時(shí)限(fAPD)：FPmin到FPmax 的時(shí)間〔8〕。興奮傳導(dǎo)速度(CV)=距離÷時(shí)間，32電極之間距離固定，興奮的時(shí)間差即為興奮傳播所需時(shí)間〔9〕。連續(xù)起搏3 w后，再次將兔麻醉，仰臥位固定在操作臺(tái)上。氣管插管，人工呼吸機(jī)輔

助通氣，呼吸機(jī)設(shè)定為呼吸頻率60次/min，潮氣量55 ml/kg，吸∶呼=1.5∶1。 修剪毛發(fā)，經(jīng)前次手術(shù)切口再次開胸暴露心臟，柔性電極MEA1、MEA2同時(shí)貼附心房肌，當(dāng)顯示儀上出現(xiàn)清晰、穩(wěn)定的場(chǎng)電位圖形時(shí)，即為設(shè)備連接成功。實(shí)驗(yàn)過程中密切監(jiān)測(cè)呼吸心跳等生命體征。

1.5給藥方法 根據(jù)各組預(yù)定給藥劑量(5、10、20、40 mg/kg)，將苦參堿經(jīng)雙蒸水充分溶解，MEA系統(tǒng)電信號(hào)采集前半小時(shí)經(jīng)兔耳緣靜脈注射給藥。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件。計(jì)量資料兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間采用重復(fù)測(cè)量資料單因素方差分析，方差齊時(shí)選用LSD-t，不齊時(shí)選用Dunnettt檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1高頻左心房起搏兔房顫模型 連續(xù)左心房起搏3 w后，當(dāng)兔體表常規(guī)心電圖示P波消失，R-R間期絕對(duì)不規(guī)則，出現(xiàn)房顫小f波，頻率至少達(dá)450次/min(圖1)，且該特征持續(xù)超過20 s，即可認(rèn)為房顫兔模型制作成功。本實(shí)驗(yàn)房顫兔模型制作成功率為100%。

2.2各組fAPD與CV比較 起搏組與對(duì)照組相比，fAPD明顯縮短，CV減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？鄥A各組與起搏組相比，fAPD、CV分別呈濃度依賴性延長(zhǎng)與加快，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2，圖3，表1。

圖1 兔體表Ⅱ?qū)?lián)心電圖

圖2 對(duì)照組、起搏組、苦參堿A組激動(dòng)傳導(dǎo)圖

圖3 苦參堿B、C、D組激動(dòng)傳導(dǎo)圖

組別fAPD(ms)CV(m/s)對(duì)照組343.75±10.750.44±0.02起搏組256.38±9.421)0.31±0.031)苦參堿A組287.34±10.832)0.34±0.052)苦參堿B組312.63±9.162)0.38±0.042)苦參堿C組338.29±12.442)0.42±0.022)苦參堿D組360.41±13.702)0.47±0.042)

與對(duì)照組比較:1)P<0.05;與起搏組比較:2)P<0.05

3 討 論

MEA技術(shù)的發(fā)明給電生理研究領(lǐng)域帶來了一次重大發(fā)展。通過多位點(diǎn)同步記錄神經(jīng)、心肌等組織的細(xì)胞外電活動(dòng)，擺脫了一直以來只能依靠膜片鉗在單細(xì)胞水平對(duì)小動(dòng)物心臟電活動(dòng)進(jìn)行研究的限制。由于各電極位點(diǎn)激動(dòng)的時(shí)間差異，可把握激動(dòng)的傳導(dǎo)方向、傳導(dǎo)途徑，計(jì)算出傳導(dǎo)速度〔10〕，由此可作為探討組織細(xì)胞群激動(dòng)傳導(dǎo)異常所致心律失常和抗心律失常機(jī)制的依據(jù)。將MEA技術(shù)作為抗心律失常藥物研發(fā)的檢測(cè)工具，填補(bǔ)了直觀藥效影響下多細(xì)胞外電活動(dòng)變化的空白。本文在慢性房顫兔模型中，應(yīng)用MEA技術(shù)進(jìn)行在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，既能直觀反映苦參對(duì)房顫電生理的影響，又能準(zhǔn)確體現(xiàn)不同濃度苦參堿之間的作用差異。

心肌電生理改變常引起心律失常的發(fā)生，而動(dòng)作電位又在心肌電生理改變中起重要作用〔11〕。心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的變化與多種離子電流有關(guān)，動(dòng)作電位時(shí)程(ADP)主要受平臺(tái)期(2期)內(nèi)向Na+、Ca2+和外向K+影響。MEA記錄的局部組織場(chǎng)電位與倒置的單細(xì)胞動(dòng)作電位形態(tài)相似，兩者變化具有內(nèi)在一致性〔12〕。房顫時(shí)心肌電生理可發(fā)生一系列變化，主要體現(xiàn)在有效不應(yīng)期和ADP縮短。本文中，起搏組fAPD明顯縮短(即ADP縮短)，符合房顫電生理變化特征，間接驗(yàn)證了連續(xù)高頻左心房起搏可成功誘發(fā)房顫。而在苦參堿的干預(yù)下，fAPD呈濃度依賴性延長(zhǎng)，表明苦參堿可逆轉(zhuǎn)房顫時(shí)電生理變化，起到阻止房顫發(fā)生發(fā)展的作用，其機(jī)制可能與影響Na+、K+、Ca2+等離子多電流運(yùn)動(dòng)有關(guān)。

研究表明，細(xì)胞動(dòng)作電位上升期瞬態(tài)鈉電流(INaT)是影響CV的一個(gè)重要因素，其密度下降又是引起房顫的重要機(jī)制之一〔13〕。INaT下降導(dǎo)致CV減慢，有利于房顫的發(fā)生發(fā)展。起搏組CV明顯下降，符合房顫時(shí)激動(dòng)傳導(dǎo)變化特征，但在苦參堿影響下，CV呈濃度依賴性加快。據(jù)此可推測(cè)苦參堿通過調(diào)節(jié)INaT密度使CV加快，進(jìn)而阻止房顫的發(fā)生和維持。除了INaT，心房肌縫隙連接蛋白(Cx)40也對(duì)CV變化起重要作用。已證實(shí)Cx40變異可明顯延緩心房肌動(dòng)作電位，增加心房肌細(xì)胞不均一性，從而促進(jìn)房顫的產(chǎn)生〔14〕。故苦參堿加快CV也很有可能是因其具有調(diào)節(jié)Cx40的作用。

綜上，苦參堿具有較好的抗房顫作用，但具體機(jī)制并不明確，期待更深入的研究。