林志強 唐學義 劉洪洲 仝蘭芝

(1濮陽市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 濮陽 457000；2河南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科；3濮陽市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

肺癌的發(fā)生是包含抑癌基因失活和癌基因激活在內(nèi)的多基因、多階段的復雜過程，尋找與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，并研究其分子機制，對于肺癌的靶向治療具有重要意義。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)4定位于17q11-12，多種人類癌癥中已發(fā)現(xiàn)TRAF4過表達，如乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌等〔1～3〕。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制TRAF4表達可降低肺癌細胞增殖〔4〕，但關(guān)于TRAF4對肺癌生物學特性的影響尚不完全清楚。替莫唑胺是一種新一代的口服烷化劑，不僅作為復發(fā)腦膠質(zhì)瘤治療藥物，在肺癌的治療中也得到廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用替莫唑胺可延長肺癌患者的生存期，增加化療敏感性〔5〕；也有研究發(fā)現(xiàn)替莫唑胺可抑制肺癌細胞活力，阻滯細胞周期〔6〕。目前關(guān)于TRAF4是否可增加肺癌替莫唑胺化療敏感性尚不清楚。因此，本研究通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默肺癌細胞TRAF4表達，探討抑制TRAF4表達后替莫唑胺單獨及共同處理對肺癌細胞增殖及凋亡的影響及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑和儀器 人胚肺成纖維細胞MRC5及肺癌SPC-A-1、A549、H322、H1299細胞均購自中國科學院上海細胞庫；替莫唑胺購自中國食品藥品檢定研究所(批號：100639-201302，純度為99.6%)；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；熒光定量試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara；CCK8細胞增殖試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細胞凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Notch1、Hes1抗體購自美國Abcam公司；酶標儀購自美國Bio Tek公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2TRAF4在肺癌細胞中的表達 MRC5、SPC-A-1、A549、H322、H1299細胞在37℃、體積分數(shù)為5%CO2的飽和濕度條件下用含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過RT-PCR方法檢測各細胞中TRAF4 mRNA表達，步驟如下：通過Trizol法提取各細胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板的反應(yīng)體系為20 μl，應(yīng)用實時熒光定量PCR儀進行擴增。引物均由上海生工合成，TRAF4的引物序列，前向：5'-CTGGACATTTGATCATGCAG-3'，反向：5'-ATTTGATCCAATAGTTGCTCGA-3'。內(nèi)參GA-PDH 的引物，反向：5'-GTCACCAGGGCTGCTTTTAA-CTC-3'，反向：5'- CAGCATCGCCCCACTTGATTTTG-3'。采用2-△△Ct比較法，根據(jù)Ct均值對TRAF4 mRNA相對含量進行定量分析。

1.3A549細胞分組及TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染細胞 A549細胞分為空白對照組、陰性對照組、TRAF4-siRNA組、替莫唑胺(200 μmol/L替莫唑胺處理細胞)和TRAF4-siRNA+替莫唑胺組，TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染A549細胞參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明，轉(zhuǎn)染前1 d以2×105/ml接種細胞于6孔板，每孔2 ml，細胞生長達到80%～90%匯合度時轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h，收集細胞，用于后續(xù)實驗。

1.4TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染A549細胞效果檢測 通過RT-PCR及Western印跡檢測TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染A549細胞效果。RT-PCR方法參照1.2。Western印跡檢測步驟：細胞中加入適量的細胞裂解液提取細胞中總蛋白，BCA法定量蛋白，每泳道加入50 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，半干法轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育一抗過夜，TRAF4及內(nèi)參GAPDH抗體分別按照1∶500和1∶1 000稀釋，洗膜，加入二抗，二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，洗膜，化學發(fā)光法在紫外凝膠成像儀上進行拍照分析。

1.5CCK8法檢測各組細胞活力 將100 μl生長至對數(shù)期的A549細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，每組細胞設(shè)置5個重復孔，并設(shè)置空白對照孔，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后按照1.3分組處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h，每孔加入10 μl的CCK8溶液，37℃孵育4 h。空白對照孔調(diào)零，酶標儀測定570 nm波長各組的吸光度值(OD)。實驗重復3次。以O(shè)D值反映細胞活力，可間接反映細胞的增殖能力。

1.6Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 磷酸緩沖液洗滌各組細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，離心后收集細胞，采用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒進行染色，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.7Caspase-3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達檢測 凋亡蛋白Caspase-3、Bax及Notch1和Hes1蛋白表達參照1.4方法檢測。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件，計量資料多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1肺癌細胞TRAF4的表達 人胚肺成纖維細胞MRC5及肺癌SPC-A-1、A549、H322、H1299細胞中TRAF4 mRNA表達分別為1、(4.557±0.423)、(5.001±0.462)、(3.889±0.387)、(4.002±0.402)，TRAF4在4個肺癌細胞中的表達均顯著高于在MRC5細胞中的表達(P<0.05)。

2.2TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞的效果 陰性對照組TRAF4的mRNA及蛋白表達與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而TRAF4-siRNA組TRAF4的mRNA及蛋白表達均顯著低于空白對照組(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測TRAF4 siRNA 轉(zhuǎn)染后肺癌A549細胞TRAF4蛋白表達

組別TRAF4 mRNATRAF4蛋白空白對照組10.765±0.076陰性對照組0.982±0.0730.718±0.071TRAF4-siRNA組0.421±0.0521)0.121±0.0151)F/P值121.428/0.000105.056/0.000

與空白對照組比較：1)P<0.05

2.3TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染增強替莫唑胺對肺癌A549細胞活力的抑制作用 TRAF4-siRNA組(0.394±0.045)和替莫唑胺組(0.351±0.040)OD值均顯著低于空白對照組(0.587±0.067，均P<0.05)，高于TRAF4-siRNA+替莫唑胺組(0.226±0.032，均P<0.05)。

2.4TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染增強替莫唑胺對肺癌A549細胞凋亡的促進作用 與空白對照組〔(2.67±0.45)%〕比較，TRAF4-siRNA組〔(7.86±0.75)%〕和替莫唑胺組細胞凋亡率〔(11.23±0.94)%〕均顯著升高(均P<0.05)，而TRAF4-siRNA+替莫唑胺組細胞凋亡率〔(15.02±1.12)%〕顯著高于TRAF4-siRNA組和替莫唑胺組(均P<0.05)。

2.5各組細胞中Caspase-3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達檢測結(jié)果 TRAF4-siRNA組和替莫唑胺組Caspase-3和Bax的表達均顯著高于空白對照組(均P<0.05)，Notch1和Hes1表達顯著低于空白對照組(均P<0.05)，TRAF4-siRNA+替莫唑胺組Caspase-3和Bax的表達顯著高于TRAF4-siRNA組和替莫唑胺組(P<0.05)，Notch1和Hes1表達顯著低于TRAF4-siRNA組和替莫唑胺組(P<0.05)。見圖2，表2。

1：空白對照組；2：TRAF4-siRNA組；3：替莫唑胺組；4：TRAF4-siRNA+替莫唑胺組圖2 各組細胞中Caspase-3、Bax、Notch1、Hes1的蛋白表達

組別Caspase-3BaxNotch1Hes1空白對照組0.103±0.0110.116±0.0140.582±0.0680.315±0.039TRAF4-siRNA組0.171±0.0181)2)0.215±0.0251)2)0.322±0.0371)2)0.214±0.0271)2)替莫唑胺組0.206±0.0231)2)0.362±0.0421)2)0.203±0.0281)2)0.195±0.0211)2)TRAF4-siRNA+替莫唑胺組0.421±0.0450.568±0.0650.110±0.0130.106±0.012F/P值75.461/0.00068.029/0.00072.240/0.00031.121/0.000

與空白對照組比較:1)P<0.05；與TRAF4-siRNA+替莫唑胺組比較:2)P<0.05

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，包括肺癌在內(nèi)的腫瘤中出現(xiàn)抑癌基因表達降低或缺失、癌基因表達升高等變化；且隨著腫瘤惡性程度變化，基因的表達量升高或降低〔7〕。這提示在肺癌治療中可采用分子靶向治療途徑。TRAF是重要的一類胞質(zhì)銜接蛋白，主要參與腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族的信號傳導。TRAF4是TNFR家族中參與腫瘤調(diào)控的因子之一，在多種腫瘤中出現(xiàn)過表達。有研究發(fā)現(xiàn)，TRAF4可通過調(diào)控Wnt信號，增強口腔鱗狀細胞癌的生長、遷移和侵襲能力〔8〕；食管癌中通過RNA干擾靶向抑制TRAF4表達可降低癌細胞的增殖、誘導凋亡，并阻滯細胞周期〔9〕。TRAF4對肺癌影響的研究不多，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-615-5p可通過靶定TRAF4，下調(diào)TRAF4表達而抑制非小細胞肺癌細胞增殖〔10〕；在異種移植小鼠模型中，敲除TRAF4表達可降低肺癌的惡性表型〔11〕。這提示TRAF4可能是肺癌發(fā)生發(fā)展中的一個促進因子。

替莫唑胺為一種化療藥物，可影響肺癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔12,13〕。RNA干擾是近些年發(fā)展起來的能夠特異性和高效性地使體內(nèi)特定基因表達阻斷的技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用〔14,15〕。本研究發(fā)現(xiàn)TRAF4的表達抑制及替莫唑胺均可降低肺癌細胞活力，誘導細胞凋亡，兩者聯(lián)合使用效果更強。Caspase-3是Caspase家族的凋亡效應(yīng)子，位于Caspase級聯(lián)反應(yīng)的下游，可被上游的始動子激活，Caspase-3的激活可引起細胞發(fā)生凋亡〔16〕。有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中Caspase-3表達降低，上調(diào)其表達可誘導細胞凋亡〔17〕。Bax是Bcl-2家族的促凋亡基因，大多數(shù)肺腫瘤細胞株中Bax表達高于正常細胞，肺癌細胞中Bax的高表達可激活Caspase，抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡〔18,19〕。Notch1信號通路進化保守，在細胞的增殖、分化、凋亡、發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用，其異常表達與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)〔20〕。Notch1的表達與肺癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和浸潤有關(guān)，抑制其表達可降低肺癌的發(fā)生發(fā)展〔21〕。本研究發(fā)現(xiàn)，TRAF4的表達抑制及替莫唑胺均可上調(diào)Caspase-3和Bax表達，下調(diào)Notch1及下游重要靶基因Hes1表達，而兩者聯(lián)合使用效果更優(yōu)。

綜上所述，抑制肺癌細胞TRAF4表達可通過下調(diào)Notch1信號通路降低癌細胞活力及誘導細胞凋亡，并可增強替莫唑胺化療敏感性；其中細胞凋亡的調(diào)控方式是上調(diào)Caspase-3和Bax表達。TRAF4可能是肺癌分子治療的有效靶點，但鑒于TRAF4在肺癌中的研究較少，且本研究也只對細胞的增殖及凋亡情況進行檢測，因此還需更多的實驗研究及臨床研究證實。