劉瑤 劉俊杰 吳寅秋 吳娟 杜鵑 王雪 李建民 趙雅寧

(華北理工大學(xué) 1護理與康復(fù)學(xué)院，河北 唐山 063000；2臨床醫(yī)學(xué)院)

依達(dá)拉奉作為一種有效的自由基清除劑，通過抑制羥基自由基依賴性和自由基非依賴性的過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮抗氧化劑的作用〔1〕。依達(dá)拉奉作為一種神經(jīng)保護劑，除了能降低自由基的濃度外，還有抗腦水腫及神經(jīng)保護功能，現(xiàn)已逐步應(yīng)用到蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)的治療過程中。SAH是臨床上一種常見的腦血管疾病，多見于創(chuàng)傷和腦動脈瘤破裂〔2〕，在急性腦血管病中大概占10%，發(fā)病率和死亡率超過50%〔3〕，已經(jīng)成為人類致殘、致死的主要疾病之一。目前研究證實，SAH后盡早地減少出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目，降低死亡率，是治療關(guān)鍵〔4〕。SAH后產(chǎn)生大量自由基，引起凋亡信號被激活，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程，造成腦組織不可逆損害。低水平的自噬可以減輕細(xì)胞凋亡，減輕SAH后早期腦損傷〔5〕。但依達(dá)拉奉在SAH后對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機制是否與自噬有關(guān)還不清楚。本實驗擬從自噬層面上探討依達(dá)拉奉對SAH后神經(jīng)元凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 依達(dá)拉奉(南京先聲東元制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050280)；3-甲基腺嘌呤溶液(上海偉進生物科技有限公司)；多克隆Beclin-1、LC3-Ⅱ抗體(SantaCruz公司)；二抗及顯色用品(美國KPL公司)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白質(zhì)定量試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；石蠟切片機(德國LEICA)。

1.2分組及模型制作 清潔級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量350～450 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。用隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組：假手術(shù)組、SAH組、3-甲基腺嘌呤組(3-MA組)和依達(dá)拉奉組(Edr組)，每組6只。參考文獻〔6〕采用血管穿刺法制備大鼠SAH模型。大鼠稱重后使用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，采取頸部前正中切口，夾閉頸總動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈，剪斷其遠(yuǎn)心端，將尼龍線斜插入頸內(nèi)動脈，到達(dá)顱內(nèi)。造模成功參考指標(biāo)：手術(shù)中出現(xiàn)呼吸急促，心率加快；麻醉清醒后精神萎靡，嗜睡、畏光等。大鼠麻醉清醒后以5 mg/kg劑量、通過腹腔注射法注射相應(yīng)溶劑，即SAH組注射生理鹽水、3-MA組注射3-MA溶液、Edr組注射依達(dá)拉奉。假手術(shù)組手術(shù)操作與SAH組相同，但不刺破大腦血管，聯(lián)合腹腔注生理鹽水。

1.3HE染色 術(shù)后24 h，10%水合氯醛深度麻醉大鼠后打開胸腔，經(jīng)心臟灌注生理鹽水至大鼠肝臟發(fā)白，隨后改用4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦，置于甲醛溶液內(nèi)保存?？v切取視交叉至大腦橫裂區(qū)域腦組織，行常規(guī)石蠟包埋、切片(片厚5 μm)、HE染色，脫水封片。光鏡下觀察海馬CA1區(qū)細(xì)胞的病理變化。每只大鼠取3張切片，每張切片在海馬CA1區(qū)隨機取5個獨立視野，計算存活與死亡細(xì)胞數(shù)并得出均值。

1.4免疫組織化學(xué)染色 行常規(guī)脫蠟水化，過氧化氫避光孵育10 min，胰酶抗原修復(fù)20 min，滴加Beclin-1多克隆抗體(1∶200稀釋)、LC3-Ⅱ多克隆抗體(1∶300稀釋)置于濕盒中4℃冰箱過夜；第二步滴加二抗置于37℃溫箱孵育30 min，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、脫水、透明、封片。實驗采用PBS代替一抗，作為陰性對照。光鏡下觀察海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞的表達(dá)情況。每只大鼠取3張切片，每張切片在海馬CA1區(qū)隨機取5個獨立視野(400×)，計算陽性細(xì)胞數(shù)并得出均值。

1.5細(xì)胞凋亡檢測 切片進行常規(guī)脫蠟、預(yù)處理組織后，使用過氧化氫室溫封閉10 min；PBS洗滌，隨后滴加平衡緩沖液，風(fēng)干多余液體立即滴加工作強度轉(zhuǎn)移酶充分覆蓋組織，并置于濕盒中溫箱孵育1 h，加入停止/洗滌緩沖液；最后滴加抗地高辛氧化酶經(jīng)室溫孵育30 min后，滴加DAB顯色、脫水、透明、封片。光鏡下TUNEL陽性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞核。每只大鼠取3張切片，每張切片在海馬CA1區(qū)隨機取5個獨立視野，計算陽性細(xì)胞數(shù)并得出均值。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和SNK檢驗。

2 結(jié) 果

2.1CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞觀察 假手術(shù)組海馬區(qū)神經(jīng)元鏡下形態(tài)規(guī)則、分層排列整齊，胞質(zhì)均勻，胞核界限清晰，核仁明顯；SAH組海馬區(qū)神經(jīng)元鏡下形態(tài)呈不規(guī)則錐形、交錯排列，核膜裂解、核固縮和溶解、核仁消失；相比于SAH組，3-MA組病理損傷明顯增重，損傷神經(jīng)元數(shù)量增加、核固縮和核溶解明顯加重；相比于SAH組，Edr組細(xì)胞損傷明顯減輕，損傷神經(jīng)元數(shù)目減少，核固縮、核碎裂和核溶解現(xiàn)象明顯減輕，但較假手術(shù)組損傷依然嚴(yán)重。見圖1、表1。

2.2細(xì)胞凋亡檢測 TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征示胞體縮小，染色質(zhì)凝集，密度增高，胞核中棕色顆粒。SAH組凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P<0.05)；相比于SAH組，3-MA組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，Edr組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)。見表1。

2.3免疫組織化學(xué)染色 假手術(shù)組鏡下視野未見陽性細(xì)胞或個別散在分布，Beclin-1、LC3-Ⅱ和Caspase-3均不表達(dá)或極低水平表達(dá)；相比于假手術(shù)組，SAH組Beclin-1、LC3-Ⅱ和Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞明顯增加(P<0.05)；相比于SAH組，3-MA組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細(xì)胞顯著減低，但仍顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，而3-MA組Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞明顯增加(P<0.05)，Edr組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細(xì)胞升高(P<0.05)，而Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞明顯降低(P<0.05)；相比于3-MA組，Edr組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細(xì)胞升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞明顯降低(P<0.05)。見表2，圖2。

圖1 各組神經(jīng)元細(xì)胞染色(HE，×400)

組別存活細(xì)胞數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組122.17±2.4814.00±2.53SAH組73.33±1.971)63.50±2.431)3-MA組69.50±2.352)67.17±2.861)2)Edr組85.17±2.401)2)51.50±1.641)2)

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05；與SAH 組比較:2)P<0.05

表2 各組海馬CA1區(qū)Beclin-1、LC3-Ⅱ、Caspase-3 陽性 細(xì)胞數(shù)的比較個/HP,n=6)

圖2 各組海馬 CA1 區(qū)Beclin-1、LC3-Ⅱ、Caspase-3染色(DAB，×400)

3 討 論

SAH發(fā)病初期病死率約為40%，30%的幸存者會遺留嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙〔7〕。SAH后通常會出現(xiàn)的并發(fā)癥是腦血管痙攣，是造成患者死亡常見的原因之一。SAH 發(fā)生后血凝塊溶解釋放的氧合血紅蛋白，會產(chǎn)生大量活性氧自由基和脂質(zhì)過氧化物，誘導(dǎo)自由基反應(yīng)，引起和加重腦血管痙攣〔8〕。隨著對SAH研究的進展，大多數(shù)入院的患者不會再次出血，由于早期腦損傷的分子機制及信號通路十分復(fù)雜，尚未找到一種有效手段可以預(yù)防或減輕腦組織細(xì)胞的早期損傷。作為經(jīng)典的氧自由基清除劑，依達(dá)拉奉能改善皮質(zhì)水腫、可抑制脂質(zhì)過氧化、有效消除自由基；因此，臨床上被用作急性腦缺血神經(jīng)保護劑；近年來，其已逐漸用于SAH的早期治療。在SAH治療的過程中，依達(dá)拉奉以其強大的自由基清除功能及抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，起到防治腦血管痙攣，發(fā)揮腦保護作用〔9〕。本研究提示依達(dá)拉奉具有減輕SAH所致細(xì)胞凋亡的作用。

細(xì)胞自噬是真核生物中一種進化上高度保守的、細(xì)胞內(nèi)成分和結(jié)構(gòu)更新的正常途徑，調(diào)控蛋白和細(xì)胞器的降解利用，參與細(xì)胞質(zhì)的重建，是保持完整細(xì)胞器和大分子蛋白降解的主要途徑，因此自噬在維持細(xì)胞的自我穩(wěn)態(tài)、適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變換及自身發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用。自噬在神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔10，11〕。Lee等〔12〕在大鼠SAH模型上發(fā)現(xiàn)受損的神經(jīng)元中Beclin-1、LC3-Ⅱ均表達(dá)升高，提示自噬可能參與自發(fā)性SAH后的早期腦損傷。且有研究證實自噬激活在SAH后早期腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程中引起神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔13〕。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉可能是通過促進自噬的表達(dá)，對海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡起到了一定的抑制作用。自噬和凋亡作為細(xì)胞死亡的兩種形式，二者之間有復(fù)雜的聯(lián)系〔14〕。自噬可清除破損線粒體，可能在一定程度上延遲了凋亡的發(fā)生，且起到對抗凋亡的作用〔15〕。本實驗從自噬層面上證實了依達(dá)拉奉有效的干預(yù)能激活自噬，減少細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護作用。