張隆業(yè) 金健 金吉哲 鄭海蘭 樸尚國(guó) 姜玉姬 李慧瑛 金英順 李燦

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎病學(xué)科，吉林 延吉 133000)

作為一種強(qiáng)有力的免疫抑制劑，他克莫司(TAC)已廣泛應(yīng)用于臟器移植、自身免疫性疾病、結(jié)締組織病、難治性腎病綜合征的治療。然而，TAC的使用常被其毒副作用所限，譬如腎毒性和移植術(shù)后新發(fā)糖尿病(NODAT)〔1,2〕。TAC急性腎毒性被認(rèn)為是可逆的，而TAC慢性腎毒性可導(dǎo)致不可逆的、進(jìn)行性的腎衰竭且需透析治療〔3〕。TAC慢性腎毒性以炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)為病理特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，炎性介質(zhì)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡與其中扮演重要角色〔4,5〕。NODAT是臟器移植后常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，發(fā)病率高達(dá)60.2%〔6〕。在諸多發(fā)病病因中，TAC所致 NODAT高達(dá)36.6%〔7〕。本課題組曾報(bào)道TAC可直接損傷胰腺β細(xì)胞，而氧化應(yīng)激起關(guān)鍵作用〔5〕。

冬蟲(chóng)夏草(CS)是一種傳統(tǒng)中草藥，富含氨基酸、微量元素、核苷酸、多肽等生物活性物質(zhì)，故具有降糖、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等特性〔8～12〕，在環(huán)孢素A腎小管損傷〔13〕、2型糖尿病(DM)〔14〕、膜性腎小球腎炎〔15〕、單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型〔16〕中均得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)利用TAC誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病(DN)動(dòng)物模型，探討CS是否對(duì)胰腺和腎臟具有保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物分組與藥物治療 體重匹配(體重240～260 g)的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(Charles River,Technology,韓國(guó))，喂飼低鹽飼料(0.05% sodium,Teklad Premier,Madison,WI,美國(guó))1 w后，隨機(jī)分為4組：①正常對(duì)照組(VH,n=8):正常大鼠皮下注射橄欖油(1 ml·kg-1·d-1);②VH+CS組(n=8):正常大鼠皮下注射橄欖油，灌胃 CS(5 g·kg-1·d-1，CS原粉(西安濟(jì)民金水寶制藥有限公司提供CS原粉，Cs-4)溶于飲用水中至5 g/ml濃度，CS劑量選擇基于以往報(bào)道〔17〕);③TAC組(n=8):正常大鼠皮下注射TAC(1.5 mg·kg-1·d-1，Prograf,AstellasPharma,Ibaraki,日本)在橄欖油(Sigma,St Louis,MO,美國(guó))中稀釋至1.5 mg-1·ml濃度);④TAC+CS組(TAC+CS,n=8):正常大鼠皮下注射TAC，灌胃CS。治療4 w后分別處死大鼠，收集血液、尿液、腎組織標(biāo)本以備進(jìn)一步檢測(cè)。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得韓國(guó)加圖立大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(CUMC-2016-0101-03)。

1.2基本檢測(cè) 定期測(cè)量并記錄各組大鼠的體重，定量酶比色法(Stanbio Laboratory,Boerne,TX,美國(guó))測(cè)定腎功能〔血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)〕及24 h尿蛋白排泄率(Modular DPP system,Roche,Hamburg,德國(guó))，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)檢測(cè)全血TAC 濃度；尾動(dòng)脈測(cè)壓法測(cè)定大鼠收縮期血壓(BP-2000,Visitech system,Apex,NC,美國(guó))。

1.3胰腺功能評(píng)估 在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢跍y(cè)定糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)并計(jì)算葡萄糖曲線下面積(AUCg)；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血漿胰島素水平(Millipore corpotation,St.Charles,Mo)；常規(guī)免疫組化法檢測(cè)胰島素免疫活性，采用彩色圖像自動(dòng)分析儀(Polygon program,TDI Scope Eye Version3.5 for Windows;Olympus,日本)高倍鏡下半定量分析。

體外測(cè)定葡萄糖刺激下的胰島素水平：糖促胰島素分泌(GSIS)，方法簡(jiǎn)述如下：首先將分離的胰島用Krebs-ringer 緩沖液(KRB：NaCl 130 mmol/L;KCl 3.6 mmol/L;CaCl21.5 mmol/L;MgSO40.5 mmol/L;KH2PO40.5 mmol/L;NaHCO32.0 mmol/L;HEPES 10 mmol/L)沖洗后，再用含有25 mmol/L葡萄糖的KRB液處理30 min，并收集上層液。最后用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Millipore Corp.,St.Charles,MO,美國(guó))測(cè)量上清液胰島素濃度。工作流程見(jiàn)圖1。

圖1 體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰島素水平的工作流程圖

1.4腎臟病理組織檢查 腎組織由過(guò)碘酸-賴(lài)氨酸-多聚甲醛液(PLP)固定，石蠟包埋后切片，行Masson trichrome三色染色，自動(dòng)圖像分析儀高倍鏡下分析TIF程度，每個(gè)標(biāo)本至少觀察20個(gè)非重疊區(qū)域并取平均數(shù)。

1.5免疫組化染色 石蠟包埋切片置二甲苯脫蠟，梯度酒精中脫水，37℃、0.3% 過(guò)氧化氫/甲醛處理30 min后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次。置微波爐中加熱行微波抗原修復(fù)(98℃ 5 min)，室溫下非免疫性血清封閉液20 min。在4℃下滴加 ED-1 單克隆抗體(Serotec Inc.,英國(guó))孵育12～16 h。PBS洗3次后滴加二抗，室溫孵育2 h。以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為底物顯色,呈棕黃色為止。自來(lái)水流水洗滌，復(fù)染蘇木素，常規(guī)樹(shù)脂封片。染色程度用數(shù)字化顯微鏡分析儀(TDI Scope Eye Version 3.0 for Windows,Olympus,日本)，Polygon程序算出每0.5 mm2染色面積的百分比。

1.6雙重免疫熒光染色 胰島素和 caspase-3 雙重染色步驟如下：一抗孵育洗滌后加入生物素化―抗兔 IgG 孵育，洗滌并滴加 SABC-Cy3 復(fù)合物，熒光顯微鏡下觀察特異性熒光，再進(jìn)行異硫氰酸熒光素(FITC)―抗小鼠 IgG(二抗)孵育，最后封片觀察。

1.7血、尿 8-羥脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)水平 根據(jù)試劑盒操作步驟，用酶聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)免疫吸附法測(cè)定血、尿 8-OHdG DNA 加合物水平(Cell BIOLABS,San Diego,CA,美國(guó))。

1.8免疫印跡法 腎組織用蛋白質(zhì)裂解液制成勻漿，室溫下離心后取上清液測(cè)蛋白濃度(Bio-Rad，Hercules)，鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；電轉(zhuǎn)膜2 h后，4℃下置〔單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1,Santa Cruz Biotechnoogy,Inc.,美國(guó)〕于非脂牛乳中以1∶1 000濃度孵育12～16 h，室溫下PBS洗3次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔 IgG(Amersham)1 h；室溫下PBS洗3次，增強(qiáng)發(fā)光(ECL,Amersham)和曝光。以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)(100%)測(cè)定條帶的光密度，以 β-actin校正。類(lèi)似方法測(cè)定白細(xì)胞介素(IL)-17,Cell signaling Technology,Danvers,MA,美國(guó))；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1,R&D Systems,Minneapolis,MN,美國(guó))；TGF-β 1誘導(dǎo)基因-h3(βig-h3,Proteintech,Chicago,IL,美國(guó))；錳超氧化物歧化酶(MnSOD,Abcam)；B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2,Millipore,Billerica,Mass)，活性的含胱氨酸的天冬酸蛋白水解酶-3(Caspase-3，Millipore,Billerica,Mass)，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax,Millipore,Billerica,Mass)。

1.9原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法 根據(jù) ApopTag in Situ Apoptosis Detection Kit(Millipore)試劑盒操作步驟測(cè)定細(xì)胞凋亡，200高倍下數(shù)字化顯微鏡分析儀計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1CS 對(duì)生化參數(shù)的影響 TAC 組大鼠表現(xiàn)為體重下降、腎功能低下(Scr和BUN升高)、24 h尿蛋白排泄率增加，而尿量(UV)和飲水量(WI)卻升高。CS 治療阻滯體重下降、腎功能低下、尿蛋白排泄率增加，然而對(duì)UV和WI無(wú)明顯改善。見(jiàn)表1。

2.2CS 對(duì)胰腺功能的影響 給予大鼠 TAC 可誘導(dǎo) DM，表現(xiàn)為 IPGTT和AUCg較VH組上升(P<0.05)；反之，血漿胰島素和GSIS水平卻下降(P<0.05)。CS均使上述指標(biāo)逆轉(zhuǎn)。胰島免疫組化(圖2)顯示，與VH組比較，TAC 抑制胰島的胰島素免疫活性〔(6.9±1.4)vs(14.6±0.8)μm2×103,P<0.05〕， CS 治療顯著增加胰島素的免疫活性〔(12.3±1.1)μm2×103,P<0.05 vs TAC組〕。見(jiàn)表2。

表1 冬蟲(chóng)夏草對(duì)生化指標(biāo)的影響

△BW：體重增加量；UV：尿蛋白；SBP：收縮壓；與VH組比較：1)P<0.05；與TAC組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組間血糖和胰島素水平

2.3CS對(duì)腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)的影響 腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)在TAC慢性腎毒性中起關(guān)鍵作用，因?yàn)檠装Y先于纖維化。TAC治療4 w導(dǎo)致腎小管間質(zhì)炎癥，表現(xiàn)為炎性介質(zhì)MCP-1和IL-17的表達(dá)增加(P<0.05)，繼之ED-1陽(yáng)性細(xì)胞在腎小管間質(zhì)大量浸潤(rùn)〔(23.1±2.5)% vs(0.5 ± 0.06)%,P<0.05,圖3A〕。CS治療不僅下調(diào)MCP-1和IL-17的表達(dá)(P<0.05，圖3B)；而且明顯減少ED-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)〔(14.8 ± 1.8)%,P<0.05 vs TAC組〕。以上結(jié)果表明，CS對(duì)TAC慢性腎毒性具有抗炎作用。見(jiàn)表3。

圖2 胰腺免疫組化和半定量分析(×400)

圖3 ED-1免疫組化(A,×400)和MCP-1、 IL-17免疫印跡(B)

2.4CS 對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化的影響 帶狀TIF 是TAC慢性腎毒性特征性的病理改變，這種變化在TAC組腎組織中顯得尤為突出(P<0.05)。病理上的變化伴隨著明顯的TGF-β1及其誘導(dǎo)基因 βig-h3較VH組高表達(dá)(P<0.05；圖4A)。CS治療顯著下調(diào)TGF-β1和βig-h3的表達(dá)(P<0.05；圖4B，表4)，改善了TIF程度(P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖4 Masson's trichrome染色(A,×400)和 TGF-β1、βig-h3免疫印跡(B)

組別胰島半定量分析(μm2×103)腎臟ED-1陽(yáng)性細(xì)胞(個(gè)/0.5 mm2)TIF(%/mm2)血清8-OHdG表達(dá)量 (ng/ml)24小時(shí)尿中8-OHdG排泄量(ng/24 h)胰島 TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2)胰島 Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2×104)腎臟TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2)Vh組14.6±0.81.0±0.10.0±0.01.4±0.195.0±18.00.8±0.22.6±0.50.6±0.1CS組15.2±1.41.1±0.20.0±0.01.9±0.2125.3±18.00.5±0.23.9±1.01.0±0.1TAC組6.9±1.41)23.3±3.31)10.8±2.41)3.0±0.11)220.0±12.01)8.9±0.81)20.0±4.81)10.4±2.11)TAC+CS組12.3±1.11)2)14.8±1.81)2)5.5±2.31)2)1.5±0.52)151.1±16.22)3.6±0.62)7.7±0.92)5.2±1.22)

表4 各種免疫印跡檢測(cè)表達(dá)量

2.5CS 對(duì)氧化應(yīng)激的影響 與VH組相比，TAC組血、尿 8-OHdG水平明顯增加(P<0.05)；相反，抗氧化因子MnSOD蛋白的表達(dá)卻減少(P<0.05)，CS治療均使上述各項(xiàng)指標(biāo)逆轉(zhuǎn)。見(jiàn)表3，表4，圖5。

2.6CS 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 TAC增加胰腺和腎組織內(nèi)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P<0.05)，而CS治療減少其在胰腺和腎的數(shù)量(表3)。在分子水平上，雙重免疫熒光染色示胰島素和Caspase-3僅在TAC組胰島中融合顯影，提示胰島細(xì)胞凋亡與胰島素減少緊密相關(guān)(表3)。在腎組織中，CS調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比值和下調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)(P<0.05)，以利于細(xì)胞存活(表4)。見(jiàn)圖6，圖7。

圖5 血、尿 8-OHdG 水平和MnSOD免疫印跡

圖6 胰腺 TUNEL 染色(A，×400)和胰島素及caspase-3 雙重免疫熒光染色(B，×400)

圖7 腎臟 TUNEL 染色(A,×400)和 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因免疫印跡(B)

3 討 論

在鏈脲佐菌素誘發(fā)的DM大鼠模型和高脂飼料誘導(dǎo)的2型DM模型(C57BL/6J 小鼠)中，CS可發(fā)揮強(qiáng)有力的降糖作用，其降糖作用機(jī)制可能與刺激胰島素分泌和激活膽堿酯酶有關(guān)〔18,19〕，說(shuō)明在 DM 疾病中，CS 具有降糖作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道吻合，CS 明顯增加胰島素的分泌和GSIS上升，從而降低 TAC 所致高血糖(包括IPGGT 和 AUCg)。此外，CS 明顯減少胰島細(xì)胞凋亡、保持胰島大小的完整性。因此，不難推斷 CS 是通過(guò)抑制胰島細(xì)胞凋亡機(jī)制發(fā)揮降糖作用，對(duì) TAC 所致胰腺損傷具有保護(hù)作用。

CS 對(duì)膜性腎小球腎炎和2型 DN 具有抑制炎性介質(zhì)(如MCP-1 和 ICAM-1)的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，下調(diào) TGF-β1 表達(dá)，防止細(xì)胞外基質(zhì)沉積(Ⅳ型膠原蛋白)等效能〔15，20〕。上述證據(jù)表明在腎臟疾病中，CS 具有抗炎、抗纖維化作用。本研究利用 TAC 誘導(dǎo)大鼠 DN 模型，闡明 CS 對(duì)其保護(hù)的分子作用機(jī)制。本文結(jié)果表明 CS 明顯下調(diào)炎性介質(zhì) MCP-1、IL-17 的表達(dá)，隨之減少炎性細(xì)胞在腎小管間質(zhì)的浸潤(rùn)(ED-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))。此外，CS 下調(diào)致纖因子 TGF-β1 和細(xì)胞外基質(zhì)成分之一βig-h3 的表達(dá)。這種分子水平上的變化伴隨著24 h尿蛋白排泄率減少、腎功能改善、腎小管間質(zhì)帶狀纖維化的減少。此結(jié)果與以往報(bào)道〔21〕中CS發(fā)揮的腎臟保護(hù)作用極為相似，表明 CS 在 TAC 誘導(dǎo)的大鼠 DN 模型中，通過(guò)抑制 MCP-1、IL-17、TGF-β1 的表達(dá)，從而減少腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)和纖維化，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

本研究結(jié)果闡明CS對(duì)TAC所致的胰腺和腎臟損傷具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制可以是多方面的，至少兩種可能性參與其中。首先是氧化應(yīng)激損傷，因?yàn)殚L(zhǎng)期使用TAC對(duì)胰腺 β 細(xì)胞和腎近曲腎小管上皮細(xì)胞株(NRK 52E)具有增強(qiáng)氧化應(yīng)激損傷、減少抗氧化物質(zhì)的作用〔5,21〕，而CS 通過(guò)調(diào)控活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、丙二醛等水平，改善腎功能〔22〕。其次是細(xì)胞凋亡，因?yàn)門(mén)AC可直接導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞和腎小管細(xì)胞凋亡，而CS 通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡途徑緩解高脂飲食或脂多糖所致的胰腺和腎臟損傷〔23〕。在本實(shí)驗(yàn)中，CS不僅減少血、尿8-OHdG水平、增加MnSOD的表達(dá)，而且調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，從而減少胰腺和腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡。因此，CS改善TAC相關(guān)的DM和腎損傷與其抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡能力緊密相關(guān)。

在臨床實(shí)際中，使用非腎毒性的藥物有效控制 NODAT 具有深遠(yuǎn)意義，因?yàn)?NODAT 可直接損傷腎移植患者的移植物。除了像胰島素、二甲雙胍這樣的一線 DM 藥物外，近年來(lái)不斷涌現(xiàn)出新研發(fā)的藥物如二肽基肽酶-4和鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體-2抑制劑。然而，這些新藥亦帶來(lái)不可避免的副作用，譬如低血糖、泌尿系和生殖器感染、胃腸道功能紊亂〔24,25〕。因此，無(wú)副作用的傳統(tǒng)中草藥越來(lái)越受到人們青睞。大量證據(jù)證實(shí)，CS可改善腎移植患者的慢性移植腎病、肝毒性、哮喘癥狀、心血管疾病等〔26～28〕。以上效能結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以大膽假設(shè)，對(duì)臟器移植患者早期服用 CS 可獲得意想不到的益處。綜上所述，在 TAC 誘導(dǎo)的 DN 大鼠模型中，CS可降低血糖，減少蛋白尿，改善腎功能，具有良好的胰腺和腎臟保護(hù)作用。這將為臨床上使用 CS 防治 DN 提供有力的分子理論基礎(chǔ)。