(長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

丁保淼

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

王容，胡倩文，張文英

(長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

淀粉作為食物中的主要成分，按照其在人體小腸中被消化吸收的快慢分為快速消化淀粉、緩慢消化淀粉和抗性淀粉(Resistant Starch，RS)[1]。RS是α 1, 4 D-葡聚糖的線性分子，主要來(lái)源于退化的直鏈淀粉，不像普通淀粉那樣易被快速消化。一般情況下，淀粉中的RS含量與其直鏈淀粉含量之間有極強(qiáng)的相關(guān)性。Granfeldt等[2]在谷類食品的研究中發(fā)現(xiàn)，高直鏈淀粉的谷類食品RS含量為20%，比普通淀粉的谷類食品高17%，高直鏈淀粉的產(chǎn)品具有生產(chǎn)高RS的潛力。Morita等[3]在玉米淀粉的研究中也說(shuō)明了上述兩者之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。有研究通過(guò)提高直鏈淀粉含量來(lái)獲得高RS含量[4,5]。但在豌豆這個(gè)作物中，上述兩者的相關(guān)性不明顯，直鏈淀粉含量處于中等，而RS含量非常高[6]。

RS因具有降低胰島素反應(yīng)、緩解糖尿病、控制體重、促進(jìn)礦物質(zhì)離子的吸收等多種生物學(xué)功能而受到廣泛關(guān)注，在人體的健康上具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者主要從RS的類型、生理功能、測(cè)定方式以及抗性淀粉的遺傳基礎(chǔ)與改良等方面進(jìn)行綜述，以期為RS的研究與應(yīng)用提供參考。

1 RS的定義與分類

目前普遍接受的RS定義是“健康者小腸中不被吸收的淀粉及其降解物”[7]。早期RS的分類包括3種類型，即RS1、RS2和RS3，近些年又將RS4和RS5這2種類型列入其中[1,8,9]。

RS1為物理包埋淀粉?？赡苁怯捎诠攘?、種子或者塊兒莖中存在完整的細(xì)胞壁，但由于腸道中缺乏細(xì)胞壁降解酶，導(dǎo)致其不能降解細(xì)胞壁成分，從而產(chǎn)生了物理屏蔽作用，或者是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的存在使淀粉酶不能與其接觸，從而不能產(chǎn)生消化作用。

RS2為天然淀粉顆粒，通常存在于薯類和生香蕉中，因其結(jié)構(gòu)緊湊，淀粉酶和消化酶不易與其接觸[10]，RS2對(duì)淀粉酶具有強(qiáng)的抗性。具有高直鏈淀粉的玉米淀粉就是一種RS2，即使在食品加工和制備過(guò)程中仍然保持著其結(jié)構(gòu)和抗性。RS2又分為3種結(jié)晶類型(A、B、C)，其中B型結(jié)晶的抗性更強(qiáng)[11]。RS1和RS2經(jīng)過(guò)一些加工處理可以再次被淀粉酶消化[12]。

RS3稱為回生淀粉，是退化或重結(jié)晶的直鏈淀粉，主要在糊化淀粉的冷卻過(guò)程中形成，也可在保持低溫或室溫的熟食中形成。淀粉糊在低溫下儲(chǔ)存一段時(shí)間，可獲得具有高度熱穩(wěn)定性的由直鏈淀粉雙螺旋聚集而形成的B型晶體結(jié)構(gòu)，而在沸騰溫度下儲(chǔ)存則表現(xiàn)為A型結(jié)晶[13]。直鏈淀粉形成的結(jié)晶稱為RS3b，比支鏈淀粉形成的部分結(jié)晶具有更高的抗酶解性，而支鏈淀粉的結(jié)晶過(guò)程緩慢，經(jīng)55～70℃的溫度加熱處理后，可被淀粉酶降解，稱為RS3a[14,15]。RS3作為抗性淀粉的重要組成部分，受到了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[13]。

RS4稱為化學(xué)修飾淀粉，主要是一些化學(xué)修飾及官能團(tuán)的取代改變了淀粉分子的組成和結(jié)構(gòu)，從而對(duì)淀粉分解酶具有抗性，例如磷酸化淀粉、羥丙基二淀粉、乙酰化淀粉以及幾種官能團(tuán)的共同作用等。并有研究表明，被取代淀粉的抗性隨著取代度的增加而增加[16]。

RS5是直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物，它是由直鏈淀粉內(nèi)部的非極性區(qū)和脂質(zhì)之間的疏水性區(qū)域的相互作用而形成的一種單螺旋包接結(jié)構(gòu)[9]，其主要是通過(guò)促進(jìn)短鏈脂肪酸的形成，從而對(duì)α-淀粉酶產(chǎn)生抗性。

2 RS的生理功能

2.1 控制血糖，防治糖尿病

血糖生成指數(shù)(Glycemic Index,GI)反映了食物最初消化和葡萄糖吸收的應(yīng)答關(guān)系，即可以反映食物對(duì)餐后血糖的影響大小。RS的GI值比正常淀粉低，能有效降低人體餐后的血糖水平[17]，有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期攝入含有RS的食物不僅能夠降低糖尿病患者血糖水平，也能使健康人群的餐后血糖水平有所改觀[18,19]。

2.2 對(duì)腸道的調(diào)節(jié)作用

RS對(duì)腸道的調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)在結(jié)腸中細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)。其中丁酸作為結(jié)腸膜細(xì)胞的主要能量來(lái)源，會(huì)被結(jié)腸膜細(xì)胞優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)[20]，可使腸道細(xì)胞的代謝和轉(zhuǎn)化得到抑制，從而降低結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[21]。此外，SCFA能夠通過(guò)降低腸道pH而對(duì)腸道起到凈化作用[22]。另外，RS作為一種益生元，選擇性地刺激結(jié)腸中的一種或是幾種益生菌物種的生長(zhǎng)或活性，從而改善宿主健康[15]。

2.3 防止脂肪堆積，有利于控制體重

許多研究已經(jīng)表明，RS能降低各種脂蛋白及總脂質(zhì)和膽固醇的含量，通過(guò)給大鼠喂食含有25% RS含量的生馬鈴薯，顯著提高了盲腸大小以及短鏈脂肪酸(SCFA)在結(jié)腸中的吸收[23,24]。此外，在大鼠中觀察到所有脂蛋白組分中膽固醇濃度的降低，高密度脂蛋白和甘油三酯的濃度降低尤為明顯[25]。Lopez等[24]研究指出用RS代替膳食中總碳水化合物的5.4%，能使餐后脂類的氧化水平顯著提高。Aziz等[26]通過(guò)高RS含量食品喂食肥胖大鼠試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可顯著降低其體重，證明了RS具有控制體重的作用。

2.4 促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收

RS可以提高人體和大鼠中對(duì)一些礦物質(zhì)的回腸吸收。研究表明，RS可提高人類對(duì)鈣的吸收率，以及RS可提高大鼠對(duì)鈣、鎂、鋅和銅等礦物質(zhì)的吸收效率[27]。RS促進(jìn)無(wú)機(jī)鹽吸收的原因可能是SCFA使盲腸壁變得肥大，增大了無(wú)機(jī)鹽吸收的表面積，從而使各種無(wú)機(jī)離子的吸收能力增強(qiáng)[28]。

3 RS的測(cè)定

目前，AOAC 2002.02作為RS測(cè)定的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)在全球的谷類作物中通用。這是體外測(cè)定方法中的一種，其基本原理是根據(jù)RS的抗酶解性去除可消化淀粉，再根據(jù)RS溶于氫氧化鉀或者是二甲亞砜溶液能被淀粉酶溶解，從而間接測(cè)定抗性淀粉含量，因其結(jié)果可靠、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好而被廣泛接受，是目前測(cè)定RS含量最常用的一種方法。但該方法繁瑣、耗時(shí)、成本高，越來(lái)越多的研究者開始研究簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的抗性淀粉測(cè)定方法。

近紅外光譜(near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS)分析技術(shù)是一項(xiàng)簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確且高效的物理檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)被檢測(cè)樣品中某一化學(xué)成分對(duì)近紅外區(qū)光譜的吸收特性進(jìn)行定量測(cè)定[29]。通過(guò)多種分析技術(shù)的綜合應(yīng)用，例如被測(cè)物質(zhì)的濃度或是其他各種性質(zhì)的分析技術(shù)、近紅外分析技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)光譜軟件技術(shù)，建立各種組分含量和近紅外光譜有關(guān)的定標(biāo)模型，從而通過(guò)被測(cè)樣品的近紅外光譜就可快速預(yù)測(cè)出相關(guān)數(shù)據(jù)。在RS含量測(cè)定的應(yīng)用上，已在甘薯[30]、馬鈴薯[31]、水稻[32]中有所報(bào)道。

傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIRS)分析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于單糖(葡萄糖、果糖)、多糖[33](麥芽糖、蔗糖、果聚糖)、蛋白質(zhì)、脂肪[34]等成分的含量測(cè)定。FTIRS在400～4000cm-1的光譜范圍內(nèi)，峰型較尖銳，對(duì)化學(xué)鍵的振蕩頻率敏感。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將FTIR上的譜帶吸光度與不同化學(xué)鍵的振動(dòng)模式進(jìn)行匹配，峰強(qiáng)度的變化可表明由于鏈長(zhǎng)度和結(jié)晶度改變而引起的淀粉結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化，而吸收帶幅度的變化可以用來(lái)精確地表示RS形成過(guò)程中內(nèi)部和分子間氫鍵的組合[15]。與天然淀粉相比,分析各種來(lái)源RS的FTIR光譜發(fā)現(xiàn)，其化學(xué)基團(tuán)沒有發(fā)生變化，但某些譜帶的吸收強(qiáng)度和振動(dòng)幅度卻有所不同。例如通常使用1047cm-1/1022cm-1和995cm-1/1022cm-1處的吸收帶積分面積的比率來(lái)量化RS的結(jié)晶度和分子順序，1047cm-1/1022cm-1和995cm-1/1022cm-1比率越高，表明淀粉顆粒中結(jié)晶區(qū)域所占比例越高[35～37]。蓮子籽RS在995cm-1/1022cm-1的光密度比率(1.00)比天然淀粉(0.87)高，表明微晶的存在是由有序的淀粉鏈形成的。此外， RS在800～1200cm-1范圍內(nèi)的吸收強(qiáng)度(C—C、C—OH和C—H伸縮振動(dòng))均比原生淀粉弱，說(shuō)明蓮子RS發(fā)生了構(gòu)象變化[37,38]。高直鏈淀粉的RS比消化前的淀粉具有更高的1047cm-1/1022cm-1比率[36]。從退化的玉米餅中分離的RS中的—OH帶(～2930cm-1)比天然淀粉更明顯，且在RS中發(fā)現(xiàn)羧基帶(1743cm-1)與玉米淀粉的對(duì)照譜相比更顯著[39]。以上結(jié)果說(shuō)明了FTIRS技術(shù)不僅可以通過(guò)化學(xué)基團(tuán)及其特征對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，也可以和NIRS技術(shù)一樣通過(guò)建立相關(guān)模型從而對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

配有折射率檢測(cè)器的高效凝膠排阻色譜(High performance size exclusion chromatography，HPSEC)可用于RS分子量的測(cè)定。淀粉的重量平均分子量(Mw)和數(shù)量平均分子量(Mn)比值表示多分散指數(shù)(Mw/Mn)，多分散指數(shù)的值越大，分子量分布越寬[37]。通過(guò)使用SEC結(jié)合多角度光散射和折射率檢測(cè)器，經(jīng)過(guò)壓熱法、微波法和超聲波輔助壓熱法制備的純化蓮子RS的分子量分布在小于2×104g/mol的范圍內(nèi)，所占的比例為86.6%～89.9%，而分子量范圍在(2～3)×104g/mol和大于3×104g/mol的范圍內(nèi)所占的比例分別為5.6%～7.3%和7.0%，通過(guò)這些處理制備的RS的Mw/Mn在1.247和1.298之間，表明RS樣品具有相對(duì)窄的分子量分布[38]。聚合度(Degree of Polymerization，DP)表示每個(gè)聚合物鏈的葡萄糖單元數(shù)。分子量或DP的數(shù)據(jù)可以通過(guò)在HPSEC中的具有不同摩爾質(zhì)量范圍的累積重量分?jǐn)?shù)的多組分DP的組合峰而獲得。

4 RS的遺傳基礎(chǔ)

4.1 RS的形成過(guò)程及影響因素

RS主要是由大量直鏈淀粉和少量極限糊精回生聚合而成，淀粉糊化后，其晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，打亂后的淀粉分子在冷卻過(guò)程中再重新聚合、卷曲、折疊，形成新的晶體。

已有報(bào)道指出高直鏈淀粉對(duì)RS的生成有積極作用[4,5]，熱濕處理的蠟質(zhì)馬鈴薯抗性淀粉(HMT-RS)中分離出的RS與HMT馬鈴薯淀粉和HMT-RSC(快速消化淀粉)+SDS(緩慢消化淀粉)相比，具有較高比例的長(zhǎng)鏈(聚合度DP≥37)和較低比例的短支鏈(聚合度DP為6～12)，在淀粉回生過(guò)程中支鏈淀粉分子中大量短鏈中斷了具有酶抗性的微晶形成，而具有少量短鏈和大量長(zhǎng)鏈的支鏈淀粉分子優(yōu)先形成相對(duì)完美的抗消化微晶[40,41]。相對(duì)合適的DP有益于形成雙螺旋和結(jié)晶[42]。鏈長(zhǎng)為30～40個(gè)葡萄糖殘基似乎是形成RS的必要條件。另外有研究表明，少量脂類的存在對(duì)RS的形成也具有積極影響，即可提高RS的產(chǎn)率[43]。

4.2 淀粉形成的生物學(xué)基礎(chǔ)

淀粉合成關(guān)鍵酶的種類、功能及在許多作物上的研究進(jìn)展已被許多研究者所報(bào)道[44]。淀粉合成關(guān)鍵酶對(duì)RS的形成及含量的影響成為研究熱點(diǎn)。目前以下幾種酶被發(fā)現(xiàn)對(duì)RS的形成具有一定影響。

4.2.1 可溶性淀粉合成酶(SSS)

SSS具有SSSⅠ、SSSⅡ和SSSⅢ 3種同工酶類型。研究表明這3種同工酶分別負(fù)責(zé)短鏈、中等長(zhǎng)度和長(zhǎng)鏈淀粉的合成[45]。玉米、小麥、水稻等作物的SSS同工酶基因已經(jīng)基本被定位，如Jiang等[46]將水稻中編碼的SSS的基因定位在第10、2和6號(hào)染色體上。Zhou等[47]采用基于圖譜的克隆方法，首先將鑒定出的和RS形成有關(guān)的突變體b10基因定位于8號(hào)染色體上，然后對(duì)412株植物進(jìn)行大規(guī)模連鎖分析，又將基因定位在M6和M8標(biāo)記之間的456kb區(qū)域，通過(guò)Gramene數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)有缺陷的可溶性淀粉合成酶基因(SSⅢa)，負(fù)責(zé)RS的產(chǎn)生，且純合突變體ssⅢassⅢa植物具有5.8%的RS含量，是野生型R7954植物(SSⅢaSSⅢa)的3倍，接下來(lái)又證明RS的產(chǎn)生依賴于顆粒結(jié)合淀粉合成酶Waxya(Wxa)等位基因的高表達(dá)，它們共同調(diào)節(jié)水稻中的RS生物合成，且發(fā)現(xiàn)純合ssⅢa突變體與純合秈稻W(wǎng)xaWxa等位基因組合產(chǎn)生更高RS含量(6.1%)，這一發(fā)現(xiàn)為提高米飯中尤其是在亞洲南部占主導(dǎo)地位的秈米中RS含量，帶來(lái)了可喜的前景。

4.2.2 淀粉分支酶(SBE)

不同的植物類型對(duì)SBE命名不同，小麥、水稻、玉米等谷類作物中常用SBEⅠ和SBEⅡ(SBEⅡa和SBEⅡb)命名，在豌豆和馬鈴薯等中常以B(SBEⅠ)和A( SBEⅡ)來(lái)命名[48]。玉米同工酶SBE Ⅰ和SBE Ⅱ分別負(fù)責(zé)中等、長(zhǎng)鏈和短鏈葡聚糖的合成[49]。大麥中SBEⅡa和SBEⅡb的編碼基因和小麥中SBE Ⅰ的主效基因分別被定位于第2、5號(hào)和7D染色體的短臂末端[50,51]。Carciofi等[52]通過(guò)協(xié)同沉默所有SBE基因發(fā)現(xiàn)大麥籽粒胚乳內(nèi)只產(chǎn)生直鏈淀粉，且在僅含直鏈淀粉的天然淀粉、凝膠化淀粉和退化的淀粉中RS含量分別為90%、65%和68%，遠(yuǎn)超過(guò)煮熟的香蕉和馬鈴薯中的RS含量(30%)。Hazard等[53]通過(guò)SBEⅡa-A敲除突變和SBEⅡa-B剪接位點(diǎn)突變的小麥雙突變體使直鏈淀粉含量增加22%(P<0.0001)，抗性淀粉含量增加115%(P<0.0001)。

4.2.3 淀粉脫支酶(DBE)

DBE主要用于調(diào)節(jié)分支以及維護(hù)支鏈淀粉的結(jié)晶度[54]。DBE根據(jù)催化底物的不同可分為異淀粉酶(ISA)和極限糊精酶(ZPU)，后者在淀粉合成過(guò)程中起著某種程度的補(bǔ)償作用[55,56]。編碼這2種酶的基因都是單拷貝基因，在玉米、水稻、小麥等植物中發(fā)現(xiàn)編碼ISA的基因位于su1位點(diǎn)[57,58]。另外，異淀粉酶被認(rèn)為對(duì)抗性淀粉的形成有一定的影響，一種來(lái)自珊瑚菌菌株EGB的新型脫支酶Iso M，是一種典型的異淀粉酶，研究發(fā)現(xiàn)，RS含量可以隨著Iso M處理的分支時(shí)間的增加而增加，并且在I U Iso M處理24h時(shí)達(dá)到最大值(70.9%)，這與來(lái)自支鏈淀粉酶(Promozyme?D2)處理的73.9%RS含量相當(dāng)，有效的脫支活動(dòng)使Iso M成為生產(chǎn)RS的候選者，同時(shí)，基于異淀粉酶和α-淀粉酶在淀粉中形成麥芽低聚糖的特點(diǎn)， Iso M可以在淀粉加工中與其他淀粉分解酶結(jié)合使用[59]。

5 RS的遺傳改良

近10年來(lái)，國(guó)內(nèi)外育種者通過(guò)輻射誘變、化學(xué)誘變等方法來(lái)創(chuàng)造具有高RS含量的改良新品種，并取得了初步成效。

Zhou等[47]為了找到RS的新基因，通過(guò)篩選γ-輻射的雜交稻恢復(fù)系R7954，鑒定了1種突變體b10， 在熟米中有高的RS含量。Bai等[60]通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻中SBE3基因編輯，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)純合突變體，其RS含量高達(dá)10%。化學(xué)誘變的使用得到了1個(gè)RS含量較高的裸大麥品種Himalaya 292[61]。Carciofi等[52]通過(guò)沉默所有SBE基因，發(fā)現(xiàn)大麥籽粒胚乳內(nèi)只產(chǎn)生直鏈淀粉，且僅含直鏈淀粉的天然淀粉中有高含量的RS(90%)。張志轉(zhuǎn)[62]通過(guò)對(duì)蘇麥6號(hào)干種子誘變，在M3代中篩選鑒定了1個(gè)RS含量較高且表達(dá)穩(wěn)定的突變株系，在M4代中分析發(fā)現(xiàn)其RS含量比蘇麥6號(hào)高7倍，定名突變體WRS-1。張貞彩[63]通過(guò)使用EMS誘變技術(shù)進(jìn)行RS材料的篩選，其中含量最高的材料為M08412-5。高直鏈淀粉玉米GEMS-0067品系是由譜系GUAT209：S13×(H99ae×OH43ae)的F5衍生系內(nèi)的同胞交配獲得的[64]，其是隱性直鏈淀粉擴(kuò)充基因(ae)和未知的高直鏈淀粉修飾基因(HAM)的純合突變體，它產(chǎn)生的RS含量比玉米ae單突變體高約25%[65]。Lee等[66]的研究表明適當(dāng)劑量的輻射可以顯著增加玉米淀粉中的RS含量。

6 展望

攝入RS含量越高，越有助于提高人們的健康水平，然而普通熱米飯中RS含量少于3%[25,67]。基于RS的諸多益處，若增加谷物中RS的含量，不僅能為糖尿病患者提供高質(zhì)量的食物，也有助于提高人群的健康水平。在當(dāng)今時(shí)代中，人們比以往任何時(shí)候都更容易出現(xiàn)與生活方式有關(guān)的疾病，增加RS的攝入量是對(duì)抗這些疾病的健康方式[68]。但目前RS含量較高的作物新品種還不夠豐富，遺傳機(jī)理的研究也不夠深入，還需要在RS遺傳改良的路上走的更遠(yuǎn)?；蚪M編輯技術(shù)的應(yīng)用，與常規(guī)育種、化學(xué)或物理輻射誘變以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，可以以簡(jiǎn)便的方式更精確地修飾靶基因，產(chǎn)生定向誘變[69]，而且不需要復(fù)雜的回交和雜交，節(jié)約了大量的時(shí)間，在作物改良中具有相對(duì)的優(yōu)勢(shì)。Sun等[70]使用CRISPR / Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)在水稻的SBEⅠ和SBEⅡb中產(chǎn)生定向誘變，并成功地獲得了直鏈淀粉含量(25.0%)和RS含量(9.8%)顯著增加的無(wú)轉(zhuǎn)基因的純合sbeⅡb突變體，這可能對(duì)其他谷類作物的RS生物合成具有一定的參考意義。另外可以結(jié)合突變體庫(kù)的創(chuàng)制，利用分子輔助標(biāo)記育種等快速準(zhǔn)確的技術(shù)加快新產(chǎn)品的快速利用。