黃學鋒，李燕

(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，溫州 325000)

常規(guī)體外受精(IVF)的受精率通常在70%～85%，有5%～15%的周期出現(xiàn)完全受精失敗(total fertilization failure，TFF)。其主要原因是精子缺乏正常受精能力，但采用卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)通常可獲得受精。雖然ICSI已可以獲得與IVF相似的正常受精率，但ICSI后也會發(fā)生TFF(ICSI-TTF)。ICSI-TFF是指所有成熟卵子行ICSI后未能形成雄性和雌性原核，其文獻報道的發(fā)生率為1%～4%[1]。本文就ICSI-TTF的發(fā)生機制、原因以及臨床處理策略綜述如下。

一、ICSI后卵子受精失敗的機制

1.受精機制：哺乳動物卵子受精過程包含精子獲能、透明帶結(jié)合、精子卵子膜融合和卵子激活等一系列生理過程，最終導致卵子減數(shù)分裂恢復和原核產(chǎn)生。在ICSI時，卵子激活是受精的必要過程。目前認為，精子進入卵子后釋放精子特異性卵子激活因子(sperm-borne oocyte activation factor，SOAF)是卵子激活的主要機制。SOAF可引起膜電位改變，引起鈣離子釋放和震蕩，從而導致減數(shù)分裂恢復和原核產(chǎn)生[2]。

2.ICSI后卵子受精失敗的機制：ICSI后卵子受精失敗的原因可能是精子未注入卵子，但主要原因是卵子激活失敗。Flaherty等[3]對1 005個ICSI未受精卵進行Hoechst 33342核染色，通過分析精子頭核的形態(tài)、位置以及原核和極體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)只有18%的卵子形成原核顯示已被激活，82%的卵子無雌性原核形成表明未被被激活，其中，17%卵子未注入精子，83%的卵子顯示精子雖然已注入到卵子但未見原核形成。

ICSI后卵子激活失敗(oocyte activation failure，OAF)的原因可能是精子SOAF異常，也可能是卵子激活信號通路異常[2]。目前認為磷脂酶Cζ(phospholipases C zeta，PLCζ)是主要SOAF，是鈣離子振蕩誘導蛋白的最主要候選者[4]。Hachem等[5]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立PLCζ基因缺失小鼠模型，發(fā)現(xiàn)PLCζ缺失小鼠精子生成和精子質(zhì)量參數(shù)正常，但是卵母細胞不能產(chǎn)生Ca2+振蕩，表明PLCζ在觸發(fā)Ca2+震蕩過程中的重要作用。頂體后鞘WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(post-acrosomal WW-domain binding protein，WBP2NL/PAWP)也可能是鈣離子振蕩誘導蛋白之一，但尚存爭議[6]。

在SOAF觸發(fā)激活過程中，卵子需具備鈣離子釋放、震蕩、減數(shù)分裂恢復和原核形成等過程的相關(guān)正常信號通路。PIP2、IP3R、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和Ca2+相關(guān)蛋白等物質(zhì)參與這些信號通路[2]。這些物質(zhì)及相關(guān)信號通路異?？赡苁荗AF的卵源性因素[2]。

二、ICSI后完全受精失敗的原因和分析

在ICSI臨床中，不同精子和成熟卵子的質(zhì)量可能不同，并不都具有正常激活機制。ICSI技術(shù)因素可導致精子未注入卵子和卵子激活失敗。在出現(xiàn)完全受精失敗時，需要分析其原因可能是隨機的配子因素和操作技術(shù)因素，還是大部分甚至所有配子激活機制異常導致的OAF。

1.技術(shù)操作及隨機因素：技術(shù)因素主要由于精子未注入卵子或注入精子未激活卵子，包括精子制動時膜損傷不充分、回吸卵胞漿不足、注射時沒有很好地避開紡錘體位置，注射針質(zhì)量等也有可能影響ICSI受精率。在人員培訓嚴格和質(zhì)控工作到位的生殖中心，可以較容易發(fā)現(xiàn)這一技術(shù)因素。

獲卵數(shù)較少的周期發(fā)生ICSI-TTF在除外明顯精子和卵子因素后，要考慮隨機因素的可能。其理論概率可以通過實際ICSI受精率計算。以目前大部分胚胎實驗室70%～85%的ICSI受精率計算，理論上1、2和3個成熟卵子不受精的隨機概率約為15%～30%、2.25%～9%和0.3%～2.7%。這是大部分ICSI-TTF發(fā)生在獲卵數(shù)少的周期的主要原因。分析我中心2014～2017年共5 926個ICSI周期數(shù)據(jù)，共150個周期出現(xiàn)TFF，發(fā)生率為2.52%，其中1、2、3和≥4個卵周期的TTF發(fā)生率分別是26.8%、11.9%、1.9%和0.32%，而<4個和≥4個卵周期發(fā)生TFF的占比分別是78.5%和21.5%。

2.精源性因素：在采用不活動精子、嚴重畸形精子、圓頭精子和非梗阻性無精子癥睪丸精子行ICSI時可出現(xiàn)不同程度的ICSI受精率低下和TTF，這些精子的SOAF候選蛋白PLCζ可出現(xiàn)表達和定位異常[7]。正常精液參數(shù)的精子也可出現(xiàn)SOAF異常，在原因不明ICSI-TTF中，精子PLCζ陽性精子比例、總量和分布與ICSI受精率顯著相關(guān)，PLCζ的缺失、表達部位異常以及活性降低都可導致卵子激活失敗，導致ICSI受精率低下甚至是TFF的發(fā)生[8-9]。也有發(fā)現(xiàn)精子PAWP的表達水平與ICSI受精率以及胚胎發(fā)育情況相關(guān)[10]。

3.卵源性因素：異常卵子形態(tài)增加了發(fā)生TTF的風險。有報道一例形態(tài)異常的卵子，采用自身精液、供精和卵母細胞輔助激活(assisted oocyte activation，AOA)均不能受精[11]。

目前研究未發(fā)現(xiàn)有明確臨床意義的卵源性激活特異相關(guān)分子。精子釋放 PLCζ進入卵母細胞質(zhì)后，啟動了激活連鎖反應，包括PIP2、IP3R、PKC和Ca2+相關(guān)蛋白等眾多物質(zhì)參與這些不同信號通路[2]，這提示卵子因素激活失敗可能存在復雜的分子和通路機制。有文獻報道一例反復TFF，其配偶的人精子鼠卵激活實驗(mouse oocyte activation test，MOAT)顯示為正常，但卵子的30 000個基因mRNA芯片結(jié)果表明，控制細胞周期的基因表達譜發(fā)生異常[12]。

4.精源性和卵源性因素OAF的鑒別：在精子和卵子形態(tài)正常，而成熟卵子數(shù)較多(≥4～5)時，ICSI-TTF是由于技術(shù)和隨機因素導致的可能性較小，需要考慮原因不明OAF。PLCζ的檢測可能有助于鑒別精子因素，但尚不能用于臨床常規(guī)檢測。采用激活失敗夫婦的精子和卵子與供卵和供精行交叉試驗有助于鑒別精子或卵子因素受精失敗?；颊呔优c捐贈的廢棄不成熟卵子體外培養(yǎng)成熟卵子行ICSI，完全無受精，考慮精源性因素；受精率≥30%～50%，考慮卵源性因素；其他結(jié)果難以明確鑒別。也可采用患者卵子與供精ICSI試驗以幫助鑒別。采用人卵子和精子交叉試驗存在卵子來源、倫理以及體外成熟卵子本身可能存在激活異常等問題，而且當試驗卵子數(shù)量較少時增加了試驗的假陰性率，降低了試驗的可靠性。

MOAT也被用于鑒別OAF的原因。通常采用B6D2F1雜交小鼠卵子與被測精子行ICSI。MOAT激活率與正常對照相比，無顯著性差異為卵源性因素，MOAT 激活率低或無激活提示精源性因素[13]。MOAT需要設立陽性對照組、陰性對照和空白對照組，實驗結(jié)果可靠需要三組的2-細胞率分別>90%、<10%和<10%。也有文獻認為測試精子的MOAT 激活率≤20%，提示為精源性因素；MOAT 激活率在21%～84%之間，提示為精子或其他原因；MOAT 激活率≥85%，則提示為卵源性因素[14]。該方法的缺點是小鼠精子PLCζ作用不及人精子，可導致假陰性。

最近有報道采用小鼠卵鈣分析(mouse oocyte Ca2+analysis)和人卵鈣分析(human oocyte Ca2+analysis)作為鑒別精源性或卵源性因素OAF的方法[15]。

三、ICSI-TFF的臨床處理

對嚴重精子和卵子形態(tài)異常及成熟卵子數(shù)較少的ICSI周期，ICSI治療前要考慮其出現(xiàn)ICSI-TTF的風險。隨機和技術(shù)因素的ICSI-TTF再發(fā)風險小。原因不明OAF導致的ICSI-TFF較難預測，而且可反復發(fā)生[16]，需鑒別精子或卵子因素。精卵交叉試驗、MOAT和精子PLCζ的免疫熒光檢測等有助于鑒別，可作為臨床處理的主要依據(jù)。以下綜述了ICSI-TTF的臨床處理方法。

1.改善臨床促排方案，增加卵子數(shù)目，改善卵子質(zhì)量：卵母細胞核和細胞質(zhì)的不成熟狀態(tài)可能抑制卵子對精子PLCζ激活的反應[17]。在臨床實踐中應優(yōu)化促排卵方法盡可能改善卵子質(zhì)量，增加卵子數(shù)量。文獻報道這可以改善成熟卵子少導致的ICSI-TFF的受精率，雖然移植周期的活產(chǎn)率可能仍然不高[18]。

2.改善精子質(zhì)量，選擇形態(tài)正常的活精子：嚴重精子異常導致的ICSI-TFF可在治療前改善精子質(zhì)量，ICSI時選擇形態(tài)正常的活精子，但臨床少有報道?？梢越柚游膊康蜐B膨脹試驗(HOST)、Laman光譜顯微鏡等選擇活精子，也可采用形態(tài)學選擇性卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，IMSI)。

3.卵母細胞輔助激活(AOA)：AOA技術(shù)可以有效克服因OAF引起的TFF或受精率低下，并能獲得正常發(fā)育的胚胎，是目前臨床上針對反復ICSI-TFF的有效治療。AOA還應用于圓頭精子癥[19]，也有應用于高ICSI-TFF風險的不活動精子和嚴重形態(tài)異常精子[20]。

AOA的基本原理是通過增加卵母細胞內(nèi)Ca2+濃度，模擬自然受精時卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)的生理變化。AOA的方法主要有3種：機械激活、電激活和化學激活。機械激活屬于ICSI技術(shù)改良的一部分。行ICSI時，在注射針對側(cè)區(qū)域多次抽吸以增加機械刺激，可提升TFF病人的受精率和臨床妊娠率。Ebner等[21]對ICSI-TFF采用機械激活獲得53.6%的受精率和33.3%的妊娠率。Tesarik等[22]也認為反復抽吸卵母細胞胞質(zhì)可以增加溶液中Ca2+進入細胞內(nèi)，同時破壞卵胞質(zhì)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)，從而增加內(nèi)源Ca2+的釋放，達到改善患者受精結(jié)局的目的。但應注意避免因反復抽吸胞漿而造成卵母細胞死亡。

電激活法則通過對卵母細胞施加直流電，引起卵母細胞膜蛋白的重排而形成膜孔道，細胞外的Ca2+可以通過孔道內(nèi)流進入胞漿，從而誘發(fā)細胞內(nèi)Ca2+濃度升高。Manipalviratn等[23]利用電激活技術(shù)，ICSI后胚胎形成率從16%提高到80%。但基于電激活操作的安全性和復雜性考慮，目前采用電激活進行AOA的臨床報道較為少見。

化學激活法由于非侵入性和操作便利性在臨床上應用最為廣泛。目前有Ca2+載體、氯化鍶(Strontium chloride，SrCl2)、無水乙醇和6-二甲基苯胺嘌呤(6-dimethylaminopurine，6-DMAP)、嘌呤霉素(puromycin)等化學激活劑。Ca2+載體、嘌呤霉素和6-DMAP能夠增加膜穿透性，通過 Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運觸發(fā)Ca2+內(nèi)流，迅速產(chǎn)生單個Ca2+峰，促進卵母細胞激活。氯化鍶、無水乙醇可以將細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放到胞質(zhì)內(nèi)形成鈣震蕩[2，24-25]。其中A23187和離子霉素(ionomycin)是最常用的Ca2+載體激活劑。一項涵蓋14項研究的Meta分析[26]顯示，鈣離子載體可以顯著提高受精率、卵裂率、囊胚形成率、臨床妊娠率以及活產(chǎn)率。A23187還具有改善胚胎發(fā)育潛能的作用，一項前瞻性多中心研究[27]顯示，在具有胚胎發(fā)育阻滯、發(fā)育延遲或者之前囊胚形成率很低的患者中，應用A23187可以顯著提高2-細胞卵裂率(98.5% vs.91.9%)、囊胚形成率(47.6% vs.5.5%)、種植率(44.4% vs.12.5%)、臨床妊娠率(45.14% vs.12.8%)和活產(chǎn)率(45.14% vs.12.8%)。Nikiforaki等[28]在B6D2F1小鼠卵和人卵中比較了離子霉素和A23187的激活效率，結(jié)果顯示離子霉素誘導的卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+振幅更高、區(qū)域更廣。在鼠卵中，離子霉素的激活效率顯著超過A23187，而在人卵中，離子霉素的激活率也高于A23187，雖然差異無統(tǒng)計學意義。另一項RCT研究[29]表明，雖然SrCl2和A23187都能改善臨床結(jié)局，但這兩種激活劑對不同的病人作用不同。SrCl2的作用在低受精史的病人中優(yōu)于A23187，但A23187在男性因素的病人中的作用優(yōu)于SrCl2。因此，對不同ICSI-TFF選擇不同的化學激活劑可能有助于治療結(jié)局。

AOA技術(shù)可適用于精子和卵子因素ICSI-TFF，但應用于精子因素TFF的臨床結(jié)果較好。最新的一項研究[30]對應用AOA技術(shù)的191周期分為精子因素組(MOAT激活率≤20%)、精子相關(guān)的卵激活能力下降組(MOAT激活率為21%～84%)和疑似卵子因素組(MOAT激活率≥85%)，三組的受精率分別為70.1%、63.0%和57.3%，其中精子因素組臨床妊娠率(49.0% vs.29.4%)和活產(chǎn)率(41.2% vs.22.1%)均顯著高于疑似卵子因素組。最近的一些研究隨訪了AOA出生子代。Miller等[31]比較了83例AOA出生的子代與595例ICSI子代，兩組的子代出生缺陷率和缺陷類型、子代出生體重、孕周、胎兒性別均無顯著差異。Deemeh等[32]比較了79名AOA出生子代和89名常規(guī)ICSI子代，顯示兩組的出生缺陷、子代出生體重和發(fā)育量表評分均無顯著差異。但由于AOA可能無法完全模擬自然受精生理過程中的Ca2+周期性震蕩和頻率，其是否會改變Ca2+調(diào)控通路下游中特殊蛋白和酶的活性，是否會影響人類胚胎早期基因表達以及表觀遺傳學等，仍有待更多研究。

4.注射重組人PLCζ(recombinant human PLCζ，rhPLCζ)：向卵母細胞內(nèi)注射rhPLCζ可以顯著改善由于激活失敗導致的ICSI-TFF。Nomikos等[33]將rhPLCζ蛋白注射到人卵和鼠卵中，都可以誘發(fā)自然受精激活樣的鈣振蕩圖譜，可有效激活卵子，激活鼠卵的囊胚形成率高達60%。而且，在由于PLCζ突變導致激活失敗的人卵母細胞中，注入rhPLCζ還能起到“挽救”作用。Sanusi等[34]利用熱處理后精子建立卵子激活失敗的小鼠模型，比較了鈣離子載體、Sr2+和rhPLCζ的激活作用，發(fā)現(xiàn)Sr2+和rhPLCζ能夠獲得更高的囊胚形成率，提示注射rhPLCζ可能為一種挽救ICSI-TFF發(fā)生和治療ICSI-TFF的方法。但目前未見臨床應用報道。

5.供精或供卵治療：AOA失敗可以依據(jù)鑒別原因予以供精或供卵治療。

四、結(jié)語

ICSI-TFF臨床上少見但處理困難。獲卵數(shù)少、卵子形態(tài)和精子嚴重異常者具有較高的ICSI-TFF風險。發(fā)生ICSI-TTF后，應結(jié)合臨床和實驗室結(jié)果綜合分析原因。對技術(shù)和隨機因素導致的ICSI-TTF，可以通過改變臨床促排方案提高卵子質(zhì)量和增加獲卵數(shù)，選擇形態(tài)正常精子，ICSI操作時適當加強機械刺激等方法，以提高ICSI受精率，降低TFF的發(fā)生風險。對于原因不明OAF導致的ICSI-TTF，鑒別是精子因素或卵子因素有助于進一步的治療選擇和預后估計。對精子和卵子因素激活失敗導致的ICSI-TTF，再次ICSI時結(jié)合AOA可以顯著提高受精率、卵裂率和治療結(jié)局。AOA對精子因素的ICSI-TTF的治療結(jié)果更好。但AOA臨床應用應有嚴格的指征，應在患者充分知情同意的基礎上慎重使用。AOA的子代安全性仍需要長期隨訪的研究。