王珺，陳書強(qiáng)，趙男，張亨德，李懋，王曉紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038)

近年來，隨著人類輔助生殖技術(shù)(ART)的廣泛應(yīng)用，其子代安全性問題日益引起人們的重視[1-2]。而ART后自然流產(chǎn)胚胎可能在一定程度上反映ART對胚胎遺傳物質(zhì)的影響。因此，研究ART后自然流產(chǎn)胚胎染色體情況，對從遺傳學(xué)角度探討ART的安全性有重要指導(dǎo)意義。本研究擬通過比較自然妊娠和ART妊娠發(fā)生早期自然流產(chǎn)的孕婦年齡、胚胎染色體異常率及其分布情況，探討不同妊娠方式及年齡與胚胎染色體異常的關(guān)系，從而為ART在遺傳學(xué)上的安全性問題提供咨詢依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2014 ～2018年期間，我中心單胎早期自然流產(chǎn)或胚胎停育后行絨毛染色體非整倍性篩查的患者890例，將自然妊娠后流產(chǎn)的494例患者設(shè)為自然妊娠流產(chǎn)組，ART助孕妊娠后流產(chǎn)的396例患者設(shè)為輔助生殖妊娠流產(chǎn)組。另外將兩組患者以35歲為年齡分割界限，又分為<35歲組和≥35歲組。

二、研究方法

早期自然流產(chǎn)患者無菌清宮手術(shù)過程中，取絨毛組織15～20 mg，生理鹽水清洗絨毛組織至無血液殘留，剔除蛻膜，將絨毛組織剪碎，采用QIAGEN QIAamp DNA mini Kit(Cat.No.51304凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司，德國)進(jìn)行絨毛全基因組DNA提取，IonProton二代測序技術(shù)(Life Technologies)行檢測染色體非整倍性檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、流產(chǎn)患者基本信息及流產(chǎn)組織染色體情況

自然妊娠組患者平均年齡及流產(chǎn)孕周顯著小于輔助生殖妊娠流產(chǎn)組(P<0.01)。兩組之間染色體非整倍性發(fā)生率及性染色體組成情況均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同妊娠方式早期流產(chǎn)患者基本信息及流產(chǎn)組織染色體情況[(-±s)， %]

注：與自然妊娠流產(chǎn)組相比，*P<0.01

二、流產(chǎn)組織染色體異常分布

流產(chǎn)組織中，染色體異常樣本共計501例，1～22號，X，Y單一染色體異常382例，三倍體異常15例，≥2條染色體異常46例，染色體微缺失/重復(fù)58例。染色體出現(xiàn)單一異常的發(fā)生率最高，達(dá)76.25%。單一發(fā)生的染色體異常中，16號染色體異常102例，占26.70%，22號染色體異常及X染色體異常均有54例，發(fā)生率均為14.14%。所有流產(chǎn)組織中，無論何種妊娠方式，均無1號染色體及5號染色體異常記錄(圖1)。

圖1 流產(chǎn)組織染色體異常分布

三、不同妊娠方式流產(chǎn)組織染色體異常發(fā)生率分析

對于同一類染色體異常，不同妊娠方式流產(chǎn)組的發(fā)生率不同。輔助生殖妊娠流產(chǎn)組69，XXN占比(0.86%)顯著低于自然妊娠流產(chǎn)組(4.83%)(P<0.01)，而21號染色體異常占比(5.60%)顯著高于自然妊娠流產(chǎn)組(2.23%)(P<0.05)。除此以外的其它染色體異常在兩組占比無顯著差異(P>0.05)。自然妊娠流產(chǎn)組織中有6例為21三體，輔助生殖妊娠流產(chǎn)組織中有9例為21三體，兩者相比無顯著差異(P>0.05)。兩組患者平均年齡亦無顯著差異(P>0.05)。輔助生殖妊娠流產(chǎn)組織中存在4例21單體，而自然妊娠流產(chǎn)組織中無該異常(圖2，表2)。

四、不同妊娠方式及年齡分組對流產(chǎn)組織染色體異常的影響

輔助生殖妊娠流產(chǎn)組≥35歲流產(chǎn)患者占比顯著大于自然妊娠流產(chǎn)組(P<0.001)。不同妊娠方式組內(nèi)，<35歲患者染色體非整倍性發(fā)生率顯著低于≥35歲患者(P<0.01)。

染色體非整倍性高發(fā)類型中：16號染色體異常發(fā)生率在<35歲患者中顯著高于≥35歲患者(P<0.01)，而不同妊娠方式間無顯著差異(P>0.05)；22號染色體異常發(fā)生率在≥35歲人群中顯著高于<35歲人群(P<0.01)，而不同妊娠方式間無顯著差異(P>0.05)；≥35歲患者≥2條染色體異常發(fā)生率顯著高于<35歲患者(P<0.001)，且輔助生殖妊娠流產(chǎn)組顯著高于自然妊娠流產(chǎn)組(P<0.01)(表3)。

與自然妊娠流產(chǎn)組相比，*P<0.05，**P<0.01

組 別例數(shù)21號染色體異常(三體+單體)21三體21單體總例數(shù)患者平均年齡例數(shù)患者平均年齡例數(shù)患者平均年齡自然妊娠流產(chǎn)組2696(2.23)32.17±4.546(2.23)32.17±4.540—輔助生殖流產(chǎn)組23213(5.60)?32.62±4.639(3.88)32.00±5.104(1.72)34.00±3.56

注：與自然妊娠流產(chǎn)組比較，*P<0.05

表3 流產(chǎn)組織染色體異常與不同妊娠方式及年齡的關(guān)系[(-±s)， n(%)]

注：與輔助生殖流產(chǎn)組比較，aP<0.001；與同組≥35歲患者相比較，bP<0.01，cP<0.001

討 論

促排卵和配子及胚胎的體外操作是ART的主要組成部分。理論上，長時間和超生理劑量的外源性促性腺激素的使用可能會增加卵母細(xì)胞在第一次減數(shù)分裂時對環(huán)境的敏感性，使微管的機(jī)能失調(diào)，并且可能使質(zhì)量低下、本應(yīng)該閉鎖的那部分卵母細(xì)胞因為卵巢刺激越過主導(dǎo)卵泡的自然選擇過程而被募集[3]。這些均可能會引起DNA的復(fù)制錯誤、DNA不穩(wěn)定、減數(shù)分裂過程異常及姐妹染色單體交換頻率增加[4]。而實際上Meta分析的結(jié)果表明ART技術(shù)不會增加染色體非整倍性的發(fā)生[5]。本研究結(jié)果顯示，494例自然妊娠流產(chǎn)患者與396例輔助生殖妊娠流產(chǎn)患者的染色體異常發(fā)生率及性染色體組成情況并無顯著差異(P均>0.05)，這與Meta分析結(jié)果一致。

兩組患者中，輔助生殖流產(chǎn)患者平均年齡以及流產(chǎn)孕周大于自然妊娠流產(chǎn)患者，這與ART患者人群的特殊性相關(guān)。可能原因：(1)此類患者一般都經(jīng)歷了自然妊娠失敗，反復(fù)早期流產(chǎn)或不良孕產(chǎn)史，在不斷嘗試而未獲得健康嬰兒出生的情況下，再來尋求輔助生殖技術(shù)助孕，勢必平均年齡偏大；(2)患者通過ART助孕成功后，臨床上通常會采用孕激素及雌激素類藥物對珍貴兒進(jìn)行保胎，使得不可避免的流產(chǎn)的發(fā)生有所滯后，因此造成流產(chǎn)的平均孕周偏大。

所有研究對象中非整倍性流產(chǎn)組織共計501例，從染色體異常類型上來看，單一染色體異常占比最高，達(dá)76.25%。其中，16號染色體異常發(fā)生率最高(26.70%)，其后依次是22號、X、15號、13號、21號染色體異常，這與文獻(xiàn)結(jié)論一致[6-7]。

比較不同妊娠方式流產(chǎn)組織染色體異常占比，輔助生殖妊娠流產(chǎn)組69，XXN占比顯著低于自然妊娠流產(chǎn)組(0.86% vs.4.83%，P<0.01)。69，XXN胚胎的可能形成機(jī)制有如下幾點(diǎn)：(1)2條精子進(jìn)入卵母細(xì)胞；(2)二倍體的精子進(jìn)入卵母細(xì)胞或者1個正常的精子進(jìn)入二倍體的卵母細(xì)胞；(3)卵母細(xì)胞內(nèi)第2極體滯留以致形成2個雌原核和1個雄原核；(4)原核碎裂[8]。其中最常見的原因是2條精子進(jìn)入卵母細(xì)胞，即3PN胚胎。輔助生殖技術(shù)可以識別3PN胚胎并不予移植，這排除了大部分69，XXN胚胎臨床妊娠的機(jī)會，而對于其他可能的形成因素，輔助生殖技術(shù)并不能很好的避免。因此，本研究中輔助生殖妊娠流產(chǎn)組織中仍有2例69，XXN核型。相比輔助生殖妊娠，自然妊娠狀態(tài)下機(jī)體并不能識別原核期3PN胚胎，而3PN往往不影響胚胎的早期發(fā)育，這可能是自然妊娠流產(chǎn)組織中69，XXN胚胎稍微多見的原因。

此外，輔助生殖妊娠流產(chǎn)組21號染色體異常占比高于自然妊娠組(5.60% vs.2.23%，P<0.05)。21號染色體異常中包含21三體異常與21單體異常。輔助生殖妊娠流產(chǎn)組21三體占比雖然高于自然妊娠流產(chǎn)組，但并無顯著差異(P>0.05)。值得關(guān)注的是，21單體是輔助生殖妊娠流產(chǎn)組中的特有現(xiàn)象。文獻(xiàn)顯示，有25%～30%的人類未受精卵為非整倍性，這類卵母細(xì)胞在自然妊娠或IVF助孕中不能受精，而ICSI技術(shù)的出現(xiàn)可能會促進(jìn)異常卵母細(xì)胞的受精[9]。這可能是因為，在自然妊娠中21號染色體缺失的卵母細(xì)胞與染色體正常精子相結(jié)合，或者染色體正常的卵母細(xì)胞與21號染色體缺失的精子相結(jié)合，均會出現(xiàn)受精障礙，不能形成臨床妊娠，因此自然妊娠流產(chǎn)組的流產(chǎn)組織檢測結(jié)果中無21單體異常。而同樣的精子或卵母細(xì)胞異常情況，ICSI技術(shù)能夠幫助精卵突破受精障礙，使得21單體的胚胎繼續(xù)發(fā)育，甚至實現(xiàn)臨床妊娠，但最終難逃流產(chǎn)的命運(yùn)，因此在輔助生殖妊娠流產(chǎn)組的流產(chǎn)組織中可見21單體異常。本研究結(jié)果顯示，4例21單體流產(chǎn)的輔助生殖妊娠患者，均是通過ICSI技術(shù)助孕成功妊娠的，這在一定程度上驗證了這一可能原因。

女性年齡與卵母細(xì)胞質(zhì)量有密切關(guān)系。女性在35歲之后受孕率開始下降，流產(chǎn)率開始上升。主要原因是35歲以后卵母細(xì)胞染色體非整倍性概率明顯增加[10]。因此，35歲成為高齡孕婦的界定標(biāo)準(zhǔn)[7]。本研究中，將不同妊娠方式流產(chǎn)患者以35歲為界，細(xì)分為<35歲和≥35歲兩個亞組。結(jié)果顯示，四組之間染色體非整倍性發(fā)生率的顯著差異來源于患者年齡，與妊娠方式無關(guān)。意味著患者年齡越大，染色體非整倍性發(fā)生率越高。單獨(dú)分析染色體異常的高發(fā)類型，22號染色體異常、≥2條染色體異常在高齡患者流產(chǎn)中高發(fā)。Pylyp等[11]發(fā)現(xiàn)<25歲時流產(chǎn)絨毛染色體異常占比為46.4%，而>40歲時流產(chǎn)絨毛染色體異常占比增長為63.2%。Dai等[12]發(fā)現(xiàn)女性年齡≥40歲時，胎兒染色體異常占比達(dá)60.61%，且伴隨3次自然流產(chǎn)史的高齡女性，其胎兒染色體異常數(shù)目也會增加。母親年齡是迄今唯一被證實的與生殖細(xì)胞非整倍體發(fā)生密切相關(guān)的因素。大于35 歲女性卵母細(xì)胞的染色體非整倍體率明顯上升，這可能與高齡女性卵母細(xì)胞減數(shù)分裂重組錯誤、紡錘體聚合檢驗點(diǎn)蛋白缺陷和cohesion 蛋白減少等有關(guān)[13-14]。但并不是所有染色體異常都與女性年齡相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，15號染色體和Turner綜合征與女性年齡并不相關(guān)，而16號染色體異常更好發(fā)于低齡流產(chǎn)患者。形成這些差異的遺傳基礎(chǔ)尚不明確，有可能與父方年齡相關(guān)，也有可能與外界環(huán)境影響相關(guān)，仍需進(jìn)一步研究分析。

總的來說，通過本中心輔助生殖妊娠流產(chǎn)患者與自然妊娠流產(chǎn)患者的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)輔助生殖妊娠組流產(chǎn)組織染色體的非整倍性并未增加，說明我中心并沒有因為促排卵不當(dāng)增加胚胎染色體非整倍性的發(fā)生率。但是兩種妊娠方式在個別染色體異常占比以及染色體異常類型中表現(xiàn)出了統(tǒng)計學(xué)差異。我們認(rèn)為21號染色體異常在輔助生殖妊娠流產(chǎn)組中占比增加，可能與ICSI技術(shù)操作導(dǎo)致21單體增加相關(guān)；22號染色體異常及≥2條染色體異常在輔助生殖妊娠流產(chǎn)組中高發(fā)，可能與輔助生殖人群年齡偏大相關(guān)，且輔助生殖人群合并有各種不孕因素，這也可能是流產(chǎn)發(fā)生的誘因[16]，我們將在以后的研究中進(jìn)一步分析討論。