趙 麗，王顯鳳

1．成都市第七人民醫(yī)院 藥劑科(成都 610041)；2. 陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院 藥學部(重慶 400042)

遠志橙皮口服液是由遠志酊、橙皮酊等組成的鎮(zhèn)咳祛痰復方制劑，臨床主要針對上呼吸道感染及肺炎所致的咳嗽、咯痰等癥狀，其療效肯定。遠志酊是遠志流浸膏加60%乙醇混合去除不溶性雜質制成的酊劑[1]，對痰不易咳出的咳嗽效果明顯；橙皮酊是以橙皮為原料提取加工制成的酊劑[2]，對痰多引起的咳嗽效果明顯。目前，由于該制劑質量標準尚缺乏對遠志酊和橙皮酊的含量測定，影響了其臨床應用。本研究擬采用HPLC法對遠志橙皮口服液中遠志酊所含細葉遠志皂苷和橙皮酊所含橙皮苷進行含量測定[3-4]，在確保臨床用藥安全有效的同時進一步加強其質量穩(wěn)定可控。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Agilent 1200系列安捷倫高效液相色譜儀(Agilent Chemstation工作站，安捷倫科技有限公司)； 賽多利斯 BT25S 電子天平[Max 21 g,d=0.01 mg,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；KQ-500E型超聲波清洗器(頻率：40 kHz，超聲電功率：500 W，清洗容量：22.5 L,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.1.2 試劑 國家藥品標準物質細葉遠志皂苷(使用前不需要干燥處理，2～10 ℃保存，批號：100033-201308，特性量值：含量以91.6% 計，規(guī)格：20 mg/支)和橙皮苷(使用前不需要干燥處理，2～10 ℃保存，批號：110721-201115，特性量值：含量以96.1%計，規(guī)格：20 mg/支)均由其研制發(fā)行單位中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為B&J ACS/HPLC溶劑，磷酸、鹽酸、正丁醇等均為AR試劑，水為超純水；遠志橙皮口服液 (自制，批號：150506-S1、150506-S2和150506-S3)。

1.2 方法

1.2.1 遠志橙皮口服液細葉遠志皂苷含量測定 1)色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.05%磷酸溶液(62∶38)為流動相；檢測波長為210 nm；流速為1.0 mL/min；進樣體積為10 μL。2)對照品溶液制備：打開1/10萬天平，預熱穩(wěn)定30 min，取潔凈的10 mL容量瓶放進電子天平，待讀數(shù)穩(wěn)定后調零，加入國家藥品標準物質細葉遠志皂苷適量，記錄好稱量數(shù)據(jù)，加色譜甲醇超聲使溶解并定容制成0.840 g/L的溶液，再精密吸取適量加色譜甲醇稀釋至濃度為每mL含0.420 mg的溶液，即得。3)供試品溶液制備：精密量取搖勻的遠志橙皮口服液20 mL置圓底燒瓶中，蒸干，冷至室溫，加入10%NaOH溶液20 mL于容器中，用電熱套加熱回流2 h， 冷至室溫，用滴液管加入HCl試液，搖勻，用潔凈棉簽另一端浸蘸試液在精密試紙(pH 0.5～5.0)上，待試紙顯色在pH值4.0～5.0后，每次用20 mL水飽和正丁醇振搖提取3次，分取正丁醇液，蒸干，放至室溫，加色譜甲醇分次溶解洗脫并轉移至10 mL棕色容量瓶中定容，搖勻，即得。4)陰性對照溶液制備：取缺遠志酊的陰性樣品(按照遠志橙皮口服液工藝制備)，按“1.2.1.3)”項下同一方法制備，即得。

1.2.2 遠志橙皮口服液橙皮苷含量測定 1)色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.1%醋酸溶液(37∶63)為流動相；檢測波長為284 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量體積為10 μL。2)對照品溶液制備：打開1/10萬天平，預熱穩(wěn)定30 min，取潔凈的10 mL容量瓶放進電子天平，待讀數(shù)穩(wěn)定后調零，加入國家藥品標準物質橙皮苷適量，記錄好稱量數(shù)據(jù)，加色譜甲醇超聲使其溶解并定容制成濃度為0.200 2 g/L溶液，再精密吸取適量加色譜甲醇稀釋至濃度為4.0 mg/L溶液，即得。3)供試品溶液制備：用計量檢定合格的單刻度胖度移液管吸取搖勻的遠志橙皮口服液10 mL，加入計量檢定合格的25 mL棕色容量瓶中，加色譜甲醇至刻度線，超聲10 min， 靜置5 min，取上清液，即得。4)陰性對照溶液制備：取缺橙皮酊的陰性樣品(按照遠志橙皮口服液工藝制備)，按“1.2.2.3)”項下方法制備，即得。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分別對3批遠志橙皮口服液中細葉遠志皂苷和橙皮苷的含量結果數(shù)據(jù)進行單因素方差分析檢驗；標準曲線線性回歸方程及其他描述性分析(均值及相對標準偏差RSD%)采用Excel軟件處理，RSD%值應符合《中國藥典》2015年版四部藥品質量標準分析方法驗證指導原則相關要求。檢驗水準α除特別說明外均設定為0.05。

2 結果

2.1 遠志橙皮口服液細葉遠志皂苷含量測定

2.1.1 專屬性實驗 按“1.2.1.1)”項下色譜條件測定結果顯示供試品色譜中的細葉遠志皂苷色譜峰與其他成分色譜峰達到基線分離，且缺遠志酊陰性對照色譜圖中相應位置未出現(xiàn)細葉遠志皂苷干擾色譜峰(圖1)。

圖1 細葉遠志皂苷對照品(A)、供試品(B)、陰性樣品(C)HPLC圖

2.1.2 線性關系考察 分別自動吸取濃度為0.840、 0.630、0.504、0.420、0.336、0.210和0.042 g/L的細葉遠志皂苷對照品溶液各10 μL，按“1.2.1.1)”項下色譜條件測定其峰面積，通過Excel軟件得到回歸方程為A=3 112.7C-0.142 9，r=0.999 9 (n=7)。結果表明，細葉遠志皂苷進樣濃度在0.042～0.840 g/L呈良好線性關系。

2.1.3 精密度試驗 細葉遠志皂苷對照品溶液連續(xù)6次進樣測得的峰面積RSD為0.48%，表明儀器進樣精密度良好。

2.1.4 重復性試驗 取6份遠志橙皮口服液(批號：150506-S2)，平行測定每一份樣品的細葉遠志皂苷含量，通過Excel軟件計算平均含量為0.165 3 g/L，RSD為0.57%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 分別于0、1、4、8、12和24 h測定重復性項下同一供試品溶液中細葉遠志皂苷峰面積的RSD為0.82%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.1.6 回收率試驗 取搖勻的遠志橙皮口服液(批號：150506-S2)，精密量取10 mL，共9份。前3份按80%比例、中間3份按100%比例、后3份按120%比例分別精密加入國家藥品標準物質細葉遠志皂苷適量，加水補足至20 mL，按“1.2.1”項下含量測定方法測定其含量，通過Excel軟件計算細葉遠志皂苷的回收率，其平均加樣回收率為101.12%，RSD為1.14%(表1)。

表1 遠志橙皮口服液中細葉遠志皂苷加樣回收率試驗結果(n=9)

2.1.7 含量測定 取本品3批，每批各3份，搖勻，按“1.2.1”項下細葉遠志皂苷含量測定方法測定其含量，結果顯示3批遠志橙皮口服液中細葉遠志皂苷含量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 3批遠志橙皮口服液中細葉遠志皂苷的含量測定結果(n=3)

2.2 遠志橙皮口服液中橙皮苷含量測定

2.2.1 專屬性試驗 按“1.2.2.1)”項下色譜條件分別對“1.2.2.2)、1.2.2.3)、1.2.2.4)”項下溶液進行測定，在該色譜條件下，缺橙皮酊陰性樣品在橙皮苷對照品色譜峰位置無陰性干擾，供試品溶液色譜中的橙皮苷色譜峰與其他成分色譜峰達到良好的基線分離(圖2)。

圖2 橙皮苷對照品(A)、供試品(B)、陰性對照(C)HPLC圖

2.2.2 線性關系考察 分別自動吸取10 μL濃度為0.6、1.0、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 mg/L的橙皮苷對照品溶液，按“1.2.2.1)”項下色譜條件測定其峰面積，通過Excel軟件得到回歸方程為A=35.159C-1.292 4，r= 0.999 9(n=7)。結果顯示橙皮苷在濃度為0.6～40.0 mg/L具有良好線性關系。

2.2.3 精密度試驗 連續(xù)6次自動進樣測定同一橙皮苷對照品溶液的峰面積RSD為0.37%，表明儀器進樣精密度良好。

2.2.4 重復性試驗 取6份遠志橙皮口服液(批號：150506-S2)，平行測定每份樣品的橙皮苷含量，通過Excel軟件計算平均含量為4.95 mg/L，RSD為0.65%，表明該方法重復性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 分別于0、1、4、8、12和24 h對重復性項下供試品溶液測定橙皮苷峰面積的RSD為0.70%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.2.6 回收率試驗 取搖勻的遠志橙皮口服液(橙皮苷含量為4.95 mg/L)，精密量取5 mL，共9份。前3份按80%比例、中間3份按100%比例和后3份按120%比例分別精密加入國家標準物質橙皮苷適量，加水補足至10 mL，按“1.2.2”項下橙皮苷測定方法測定其含量，橙皮苷的平均加樣回收率為101.93%，RSD為1.03%(表3)。

表3 遠志橙皮口服液中橙皮苷加樣回收率試驗結果(n=9)

2.2.7 含量測定 按前述橙皮苷含量測定方法，分別對連續(xù)3批遠志橙皮口服液(每批隨機抽取3份樣品)進行含量測定，測定結果采用方差分析，結果顯示3批遠志橙皮口服液中橙皮苷含量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 3批遠志橙皮口服液中橙皮苷含量測定結果(n=3)

3 討論

遠志酊是遠志流浸膏加60%乙醇混合后去除沉淀雜質制成的酊劑，其主要有效成分為具有祛痰、鎮(zhèn)咳、抑菌等作用的遠志皂苷類化合物，但此類化合物不穩(wěn)定，可經過堿水解轉化為穩(wěn)定的“細葉遠志皂苷”[5-6]。橙皮酊是以橙皮為原料加60%乙醇采用滲漉法提取制成，其主要有效成分中橙皮苷含量最高。大量研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，橙皮苷具有祛咳平喘、抗炎等功效。研究[2,9]表明，含遠志酊和橙皮酊的制劑均相應以細葉遠志皂苷和橙皮苷為該制劑質量控制的指標性成分，因此本實驗通過測定細葉遠志皂苷和橙皮苷的含量來控制成品的質量。

細葉遠志皂苷流動相主要以乙腈-0.1%磷酸水溶液和甲醇-0.05%磷酸水溶液兩流動相系統(tǒng)為主[9-10]，因前者乙腈毒性大、成本高，故本實驗主要選擇后者進行了70∶30，65∶35，62∶38篩選。結果顯示前兩個比例的流動相細葉遠志皂苷峰在分離度、理論塔板數(shù)等指標方面均不及后者，故確定細葉遠志皂苷含量測定的流動相最佳條件為甲醇-0.05%磷酸水溶液(62∶38)。橙皮苷流動相主要以甲醇-水和甲醇-冰醋酸-水系統(tǒng)為主[11]，最初以簡單的甲醇-水系統(tǒng)試驗發(fā)現(xiàn)橙皮苷峰形拖尾嚴重，分離效果不佳，最終以甲醇-冰醋酸-水系統(tǒng)為基礎篩選以甲醇-0.1%醋酸溶液(37∶63)作為橙皮苷含量測定的流動相最佳條件。

在制備細葉遠志皂苷供試品溶液中涉及到樣品揮干的操作中，因水浴加熱揮發(fā)太慢，影響操作時間，采用電熱套加熱，但在加熱過程中容器壁容易糊化，需注意溫度的把握，同時在加熱的同時輕輕搖動容器，將附在壁上的殘渣洗到未揮干的液體中，待液體快全部揮干時，關閉電熱套，并及時移走，以免殘渣糊化，影響含量結果；在制備橙皮苷供試品溶液中涉及到樣品加入甲醇的操作中，操作時應邊振搖邊緩緩加入甲醇，避免橙皮苷被包裹在甲醇沉淀物中，影響含測結果。

綜上所述，本實驗以細葉遠志皂苷和橙皮苷為指標建立的含量測定方法穩(wěn)定、可靠，對進一步完善遠志橙皮口服液的質量控制具有一定的參考價值。但本研究尚有不足之處：細葉遠志皂苷供試品溶液制備方法步驟相當繁雜，每個操作環(huán)節(jié)專注度要求極高，因此對操作者經驗要求較高；含量測定指標性成分較少，不能充分控制反映制劑有效性和安全性的有效成分含量及比例變化；不同的指標成分用不同的色譜條件，增加了質量檢測成本，耗時長。在后續(xù)研究工作中，嘗試同時測定本制劑多種反映其內部質量成分的含量，簡化供試品溶液制備方法，節(jié)約檢測時間和檢驗成本；同時探索建立該制劑的指紋圖譜，更精準控制藥品的有效成分含量及比例變化。