孔德華，李 燦，譚悅浩，劉 琴，胡康安，郭莉娜，鄧峰美，劉漪淪

1. 成都醫(yī)學(xué)院(成都610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 科研實驗中心(成都610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 燒傷整形科(成都610500)

肝疾病、慢性肝損傷和炎癥等刺激，使靜止的肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，ECM產(chǎn)生和消除失衡造成肝纖維化[1]。目前，研究[2-3]表明，ECM主要來自于活化的HSC，HSC在肝纖維化形成和逆轉(zhuǎn)過程中發(fā)揮著重要作用。抑制HSC的活化和增殖，減少ECM分泌，可能是防治肝纖維化的潛在策略。

細(xì)胞凋亡是受嚴(yán)格調(diào)控的死亡模式，在細(xì)胞的生長發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的作用[4]。凋亡信號觸發(fā)啟動型caspase(caspase-2,-8,-9,-10,-12)，激活并剪切下游效應(yīng)分子，這些效應(yīng)分子會剪切PARP等靶蛋白，使蛋白發(fā)生改變，成為凋亡標(biāo)志[5]。凋亡信號通路主要是線粒體內(nèi)源性凋亡通路，由細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激使線粒體外膜通透化而觸發(fā)，受BCL-2家族成員調(diào)控[6]。Bcl-2存在于線粒體外膜，抑制細(xì)胞色素C釋放，發(fā)揮抑制凋亡的作用；而Bax儲留在細(xì)胞質(zhì)中，接受信號后轉(zhuǎn)位到線粒體外膜，促進細(xì)胞色素C釋放，從而促進凋亡發(fā)生。

二甲雙胍是雙胍類降血糖藥，作為“老藥新用”的代表，具有副作用小、療效確切的特點，主要用于2型糖尿病治療。越來越多的證據(jù)[7-9]表明，二甲雙胍除了具有強大的降血糖作用外，還有強大的抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性。有研究[10-12]表明，二甲雙胍可以抑制活化的HSC增殖、遷移和炎性細(xì)胞因子表達(dá)，對腎纖維化和非酒精性脂肪肝炎具有預(yù)防作用。二甲雙胍對肝纖維化有治療作用，但其對HSC的作用機制卻還不是很清楚。本研究針對二甲雙胍對HSC的作用，探討二甲雙胍治療肝纖維化的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 動物

從成都達(dá)碩公司購進30只SPF級別，5周齡雄性C57BL/6J小鼠。飼養(yǎng)溫度為20～26 ℃，濕度為40%～70%。小鼠購回后檢疫1周，保證充足飲食和飲水。

1.2 藥物與主要試劑

二甲雙胍(Santa cruz，美國)，胎牛血清(Gibco,美國)，高糖培養(yǎng)基(DMEMH)(Gibco,美國)，胰酶(碧云天，上海)，人源血小板衍生因子(PDGF)(CST,美國)，CCK-8試劑盒(索萊寶,北京)，AnnexinV-PE/7-ADD雙染細(xì)胞凋亡檢測盒(凱基，江蘇)，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(碧云天,上海)，Ripa裂解液(碧云天，上海)，標(biāo)記物(Maker)(Thermo,美國)，α-SMA一抗(Santa cruz,美國)，B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)一抗(Santa cruz,美國)，Bax一抗(CST,美國)，Beclin1(CST,美國)，DNA修復(fù)酶(PARP)(CST,美國)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(CST,美國)，Anti-rabbit IgG(CST,美國),Anti-mouse IgG(CST,美國)，馬松染色(Masson染色)試劑盒(凱基，江蘇)等。

1.3 主要儀器

滅菌鍋(HVE-50)、干燥箱(JA-FA65)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(3111)，超凈工作臺,-80 ℃冰箱購自Thermo，倒置相差顯微鏡(CKX41)購自O(shè)LYMPUS，-20 ℃冰箱(4DF)購自海爾，流式細(xì)胞儀(Cytomics FC500 MCL)購自BECKMAN COULTER，正置熒光顯微鏡(Ⅸ-71)購自O(shè)lympus，離心機(離心機)購自湘儀，移液器(6Z58)購自eppendorf，電泳儀購自BIO-RAD，TS-1型脫色搖床購自江蘇林貝兒儀器制造公司，優(yōu)普純水儀(UPR-Ⅱ-5)購自青島正恒試驗設(shè)備有限公司,凝膠成像系統(tǒng)(5diff)購自BIO-RAD等。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將人HSC LX-2培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEMH。培養(yǎng)條件為：37 ℃，5%的CO2濃度，隔天換液，待細(xì)胞長到80%左右即進行傳代。細(xì)胞分3組：陰性對照組(PBS)、陽性對照組(PDGF-BB)和藥物組(PDGF-BB+Met)。

1.4.2 細(xì)胞增殖 胰酶消化細(xì)胞，加入培養(yǎng)基(DMEM)配制細(xì)胞懸液，96孔板中每孔加入50 μL細(xì)胞懸液，使細(xì)胞個數(shù)為1×104個，加入不含血清的DMEM饑餓2 h，加入含PDGF的DMEMH，PDGF濃度為40 ng/L，培養(yǎng)過夜。按實驗分組加藥培養(yǎng)24 h，其中二甲雙胍的濃度為0、5、10、20、40 mmol/L， 每組設(shè)置5個復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板，使其混勻，放入培養(yǎng)箱孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸收值，計算增殖活力。

1.4.3 細(xì)胞流式 按照 1.4.2操作培養(yǎng)細(xì)胞，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞，按照試劑盒的要求，將Binding Buffer、Annexin V-PE混合試液混懸細(xì)胞，避光反應(yīng)10 min，檢測前加入7-AAD試劑，孵育20 min，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot) 按照1.4.2操作培養(yǎng)細(xì)胞，其中二甲雙胍的濃度為10 mmol/L。用胰酶消化細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法測定每管蛋白濃度，上樣用沸水煮蛋白5 min，使蛋白變性。按照濃度計算20 μg蛋白的溶液體積作為上樣體積，用上樣緩沖液調(diào)整每組蛋白上樣體積一致，用10%的SDS-PAGE分離膠分離蛋白，然后濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用5%的脫脂牛奶封閉30 min，一抗(α-SMA、 Beclin1、PARP、Bax、Bcl-2、GAPDH)4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育2 h，顯影。

1.4.5 動物模型 將動物隨機分為3組：對照組(橄欖油)、模型組(CCl4)和藥物組(CCl4+Met)。檢疫完成后，對照組每周兩次腹腔注射橄欖油5 mL/kg， 模型組和藥物組腹腔注射CCl4油溶液(橄欖油∶CCl4=3∶1)，直至第5周實驗結(jié)束。第3周開始，藥物組開始腹腔注射二甲雙胍65 mg/kg(生理鹽水溶解)，模型組注射生理鹽水做陽性對照。

1.4.6 Masson染色 取小鼠肝臟，用中性甲醛固定組織，脫水后進行石蠟包埋。用石蠟切片進行Masson染色，染色結(jié)果在正置熒光顯微鏡下觀察，用Image J分析膠原纖維分泌量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制HSC的增殖

在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，受細(xì)胞環(huán)境的刺激，HSC迅速發(fā)生活化、增殖和遷移，分泌大量炎性因子如PDGF、TGF-β。為了評估二甲雙胍對活化的HSC作用，用PDGF刺激LX-2細(xì)胞，模擬肝纖維化的炎性刺激，然后將加入不同濃度的二甲雙胍培養(yǎng)24 h，檢測細(xì)胞的增殖情況。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)二甲雙胍對LX-2增殖的抑制作用隨濃度的增大而增強，IC50為42.66 mmol/L。當(dāng)二甲雙胍濃度為10 mmol/L時， 細(xì)胞活力為(70.48±0.68)%，顯示此劑量下的二甲雙胍對細(xì)胞損害小，可以作為后續(xù)實驗的依據(jù)(圖1)。

圖1 二甲雙胍對HSC增殖的影響

2.2 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)升高

PDGF刺激后，Westren blot檢測肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志α-SMA。與模型組相比，藥物組α-SMA表達(dá)量降低(38.76±0.33 vs 19.63±3.06，P<0.001)，表明活化的LX-2受到抑制。繼而檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況：與模型組相比，藥物組cleaved PARP表達(dá)量升高(26.89±0.84 vs 36.96±0.94，P=0.003)、Bax的表達(dá)高于模型組(58.32±0.43 vs 90.55±0.10，P<0.001)，而Bcl-2的表達(dá)則明顯降低(88.18±0.18 vs 22.92±0.51，P<0.001)。同時，Beclin1的表達(dá)量也明顯升高(37.38±0.38 vs 85.58±0.96，P<0.001)(圖2)。

圖2 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及灰度分析

注：A:Western blot檢測 cleaved PARP,Beclin1,Bcl-2,Bax,α-SMA蛋白表達(dá)量；B:α-SMA，cleaved PARP，Beclin1，Bax，Bcl-2灰度分析；**P<0.01，***P<0.001

2.3 二甲雙胍促進活化HSC凋亡

使用AnnexinV-PE/7-AAD凋亡試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍促進LX-2發(fā)生凋亡，當(dāng)二甲雙胍濃度為5 mmol/L時，細(xì)胞凋亡率為(4.62±0.16)%(P<0.001)。與Westren blot結(jié)果一致，顯示二甲雙胍促進活化HSC發(fā)生凋亡(圖3)。

圖3 細(xì)胞流式檢測細(xì)胞凋亡及凋亡率

注：A：不同二甲雙胍濃度對LX-2 凋亡的作用，F(xiàn)L2-A：AnnexinV-PE，F(xiàn)LA-3:7-AAD；B:細(xì)胞凋亡率；***P<0.001

2.4 二甲雙胍減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化

用Masson對小鼠肝臟染色，與對照組相比，模型組匯管區(qū)周圍膠原纖維堆積，組織纖維化明顯，而藥物組則改善小鼠病理情況(162.61±1.28 vs 109.82±0.87，P=0.003)(圖4)。

圖4 Masson染色檢測組織纖維化情況

注A:Masson染色檢測膠原纖維分泌量 (100×)； B:膠原纖維含量分析；**P<0.01

3 討論

肝纖維化是肝臟受損后產(chǎn)生的一系列病理過程，主要過程是HSC活化，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，分泌ECM和炎癥因子(如TGF-β、PDGF),當(dāng)ECM出現(xiàn)降解失衡，便形成纖維化，進一步發(fā)展為肝硬化和肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。在本研究中，使用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，通過Masson染色可以發(fā)現(xiàn)，模型組肝小葉周圍纖維增生嚴(yán)重,相反二甲雙胍治療后，纖維化情況有所好轉(zhuǎn)，這與已有的研究結(jié)果一致[11-13]，這些結(jié)果顯示二甲雙胍可以減輕CCl4導(dǎo)致的肝纖維化。

為了探究逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程中二甲雙胍對活化HSC的作用，使用PDGF刺激LX-2細(xì)胞，模擬體內(nèi)炎性環(huán)境。經(jīng)過劃痕實驗和細(xì)胞增殖實驗，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能抑制活化HSC的增殖和遷移。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，藥物組PARP表達(dá)量增加，Bax/Bcl-2的比值增加；細(xì)胞流式檢測發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞增多，這提示二甲雙胍激活了HSC的凋亡信號通路，誘導(dǎo)活化HSC凋亡。

自噬是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和死亡的重要途徑，在細(xì)胞受到應(yīng)激作用或受損時，自噬通過清除受損細(xì)胞，從而起到有利于機體的作用。目前，有研究[14-15]表明，自噬與延長壽命有關(guān)。已有研究[16-17]證明，Beclin1與Bcl-2的相互作用是決定細(xì)胞凋亡與自噬發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。Beclin1與Bcl-2的相互作用，會抑制Beclin1的聚集，從而抑制自噬的發(fā)生。最新研究[18]發(fā)現(xiàn)，自噬關(guān)鍵分子Beclin1會與凋亡相關(guān)分子Bcl-2形成Beclin1/Bcl-2復(fù)合物，阻斷體內(nèi)這種復(fù)合物的形成，增加基礎(chǔ)自噬量，可以延長小鼠壽命。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物組Beclin1的表達(dá)明顯高于PDGF-BB組和對照組，提示藥物組細(xì)胞發(fā)生了自噬。二甲雙胍作為一種AMPK激動劑[19-20]，其作用已被廣泛認(rèn)可，它可以激活細(xì)胞自噬信號通路。基于Beclin1與Bcl-2關(guān)系，猜測二甲雙胍通過增加活化HSC自噬，從而促進其凋亡，進而對抗CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化，但其機制還需進一步研究。