吳小磊，鐘晨，史金銘

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040)

1 引言

1.1 來(lái)源

鞣花酸(ellagic acid，EA)發(fā)現(xiàn)于1831年，是一種天然酚類(lèi)，廣泛存在于各種軟果、堅(jiān)果等植物組織中，例如核桃[1]，草莓[2],葡萄[3]，桃子[4]和石榴[5]等。

1.2 化學(xué)性質(zhì)及代謝形式

分子式：C14H6O8

IUPAC命名：2,3,7,8-Tetrahydroxy-chromeno[5,4,3-cde]chromene-5,10-dione

其它命名：4,4′,5,5′,6,6′-Hexahydroxydiphenic acid 2,6,2′,6′-dilactone

結(jié)構(gòu)式：

鞣花酸是沒(méi)食子酸的二聚衍生物，是一種多酚二內(nèi)酯，呈反式?jīng)]食子酸單寧結(jié)構(gòu)。它是一種黃色針狀晶體，熔點(diǎn)(吡啶)大于360℃，微溶于水、醇，溶于堿、吡啶，不溶于醚。

鞣花酸通常與葡萄糖，阿拉伯糖，西洛糖等縮合形成糖苷，但更易參與鞣花單寧(Ellagitannin，ET)的形成，植物往往通過(guò)水解鞣花單寧產(chǎn)生鞣花酸[6]。在人體中，腸道微量吸收水解鞣花單寧所釋放的鞣花酸，大部分鞣花酸進(jìn)一步被微生物群落代謝為尿石素[7-9]。這些代謝物具有生物可利用性，也具備生物學(xué)效應(yīng)，所以有人認(rèn)為尿石素才是機(jī)體攝入鞣花酸后產(chǎn)生的真正“有益成份”，是鞣花酸能作為抗癌，抗細(xì)胞增殖的活性成分的主要原因[10]。

2 生物學(xué)功能

鞣花酸具有多種生物活性功能，如抗氧化[11]，抑制增殖[12]，誘導(dǎo)凋亡[13],阻斷病毒感染[14],抑制炎癥[15],還可以作為凝血?jiǎng)16]等。

2.1 抗氧化作用

活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)是一類(lèi)含氧化合物，在體內(nèi)會(huì)損傷核酸，氧化多不飽和脂肪酸和氨基酸，甚至引起炎癥反應(yīng)等。研究表明，EA降低了ROS水平[20-21]，進(jìn)而降低了ROS對(duì)機(jī)體所引發(fā)的傷害。而在野百合堿誘導(dǎo)的小鼠肺動(dòng)脈高壓(PAH)模型中，EA處理導(dǎo)致IL-1β、NLRP3等炎癥因子表達(dá)降低，同時(shí)caspase-1的水平也受到了EA的抑制[22]。綜上來(lái)看，EA處理后氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)的減少是改善整個(gè)炎癥反應(yīng)的前提條件：首先，NLRP3炎性體參與炎癥的多功能細(xì)胞因子IL-1β的激活，而ROS的產(chǎn)生是NLRP3激活的中心[23-24]；其次，激活的NALP3復(fù)合體中的caspase-1(p20)有助于IL-1β的成熟，因此作為上游效應(yīng)引發(fā)者的ROS成為激活caspase-1，IL-1β的關(guān)鍵[24-25]?？偠灾珽A通過(guò)下調(diào)ROS，產(chǎn)生了積極的抗炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)。

除了調(diào)節(jié)ROS水平，EA也對(duì)非酶糖基化反應(yīng)中羰基類(lèi)氧化毒素的產(chǎn)生有抑制效果。蛋白質(zhì)羰基化是一種由羰基引起的不可逆的氧化反應(yīng)，被認(rèn)為是蛋白質(zhì)氧化損傷和原纖維形成的重要指標(biāo)[26]。在山梨酸鉀和葡萄糖對(duì)人血清白蛋白影響的研究中，Taghavi等[27]發(fā)現(xiàn)，加速原纖維形成的羰基化合物經(jīng)EA處理而減少，進(jìn)而影響了人血清白蛋白淀粉樣原纖維的形成，這與其它研究[11，28]結(jié)果相一致。具有抗氧化活性的EA終止了氧化反應(yīng)，進(jìn)而表現(xiàn)了一種積極的抗纖維化作用。

不僅如此，EA也對(duì)抗氧化信號(hào)通路產(chǎn)生影響。研究顯示，EA能通過(guò)上調(diào)Nrf2(Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)的表達(dá)，產(chǎn)生抗氧化效果，保護(hù)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞免受長(zhǎng)波紫外線(ultraviolet A ，UVA)引發(fā)的氧化應(yīng)激的傷害[29]；同時(shí)，EA對(duì)Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)表達(dá)也存在抑制作用[29-31]。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，Nrf2/Keap1信號(hào)通路可能是EA調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化的潛在分子機(jī)制。機(jī)體中，Keap1可以與Nrf2結(jié)合，有助于泛素化蛋白酶降解Nrf2[32]；當(dāng)?shù)退降腞OS或者親電試劑作用于Keap1時(shí)，Nrf2脫離Keap1并轉(zhuǎn)運(yùn)至核中，與Maf蛋白形成一個(gè)二聚體，結(jié)合到抗氧化劑反應(yīng)元件(ARE)或親電子反應(yīng)元件(EpRE)上，調(diào)節(jié)編碼抗氧化劑和細(xì)胞保護(hù)酶的基因的表達(dá)[33-39]。在整個(gè)過(guò)程中，Nrf2和Keap1因EA影響的改變對(duì)氧化應(yīng)激的改善非常重要。

首先根據(jù)不同模型處理方法對(duì)光譜產(chǎn)生的不同影響[9-11]，確定原始光譜的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型處理方法。實(shí)驗(yàn)先選取6張雷公藤去皮凈制完全后的打粉樣本光譜，經(jīng)平均得到1張雷公藤凈制完全打粉樣本的平均參考光譜，以其為基礎(chǔ)，在5800 cm-1～5500 cm-1與4400 cm-1～4200 cm-1的特征譜段處進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)選取雷公藤未去皮凈制的打粉樣本2批、去皮凈制完全的打粉樣本2批、未去皮凈制完全的打粉樣本2批，合計(jì)6批樣本，各掃描6張，合計(jì)36張NIR光譜，對(duì)相應(yīng)相關(guān)系數(shù)模型進(jìn)行驗(yàn)證，求得各6張NIR光譜的平均相關(guān)系數(shù)），掃描驗(yàn)證結(jié)果如下：

此外，EA還能通過(guò)上調(diào)谷胱甘肽合成酶、谷氨酸-半胱氨酸連接酶的催化亞基(GCLC)和調(diào)節(jié)亞基(GCLR)來(lái)提高谷胱甘肽水平[40]，以及誘導(dǎo)NADPH：醌氧化還原酶，血紅素氧合酶1[41-44]，超氧化物歧化酶，過(guò)氧化氫酶，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶[21，29，45]等涉及氧化還原反應(yīng)酶的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)其抗氧化活性。

2.2 放射增敏作用

放射治療是目前對(duì)腫瘤細(xì)胞治療的主要手段之一，而放射敏感性的增加對(duì)于輻射劑量的優(yōu)化和治療比率的提高有著重要意義。Das等[46]發(fā)現(xiàn)EA具有放射增敏效應(yīng)。EA和γ射線共同處理使與炎癥反應(yīng)有關(guān)的IL-6，COX-2，TNF-α的表達(dá)降低，并且導(dǎo)致血管生成標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase 9，MMP-9)水平的下降。同時(shí)，活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生和積累成為細(xì)胞凋亡的誘因，克服天然抗氧化劑的防御作用，在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并對(duì)生物分子造成損傷，其中ROS誘導(dǎo)的DNA損傷促使p53易位至細(xì)胞核，隨后與細(xì)胞周期密切相關(guān)的p21表達(dá)，細(xì)胞周期發(fā)生停滯。受EA影響的ROS在放射增敏效應(yīng)和抗氧化效應(yīng)中的相反現(xiàn)象可能歸因于研究對(duì)象和EA處理濃度的不同。此外，EA和γ射線聯(lián)合處理后，細(xì)胞出現(xiàn)的磷脂酰絲氨酸(PS)外化和線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，MMP)的喪失表明細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)，而B(niǎo)ax的過(guò)表達(dá)和caspase-3的活化表明細(xì)胞凋亡的發(fā)生。EA提高了ROS水平及凋亡相關(guān)因子的水平，這與Bhosle等[47-48]的研究發(fā)現(xiàn)一致，它們?yōu)镋A作為放射治療的輔助手段提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)臨床用藥有一定的指導(dǎo)意義。

2.3 抗增殖作用和促凋亡作用

化學(xué)合成藥物可通過(guò)抑制增殖、促進(jìn)凋亡來(lái)有效地治療癌癥，但這往往有很強(qiáng)的副作用。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)包括鞣花酸在內(nèi)的一些天然活性物質(zhì)[49-51]，具有抗增殖、促凋亡的特性。

Hong等[12]發(fā)現(xiàn)，EA抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖且使細(xì)胞主要在G0/G1期發(fā)生停滯，效果呈時(shí)間和劑量依賴性。EA處理24h后， cDNA微陣列的分析結(jié)果預(yù)示了對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)途徑有調(diào)節(jié)作用的16個(gè)基因(TGF-β1，TβR-Ⅰ，TβR-Ⅱ，Smad3，p-Smad3，Rb1，p-Rb1等)有明顯變化，也正因此，TGFβ/Smads信號(hào)通路被認(rèn)為是鞣花酸調(diào)控乳腺癌細(xì)胞周期阻滯的潛在分子機(jī)制。其中，由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)攜帶的細(xì)胞因子信號(hào)將通過(guò)I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(TβR-I和TβR-II)的異源性復(fù)合物來(lái)傳遞，配體結(jié)合導(dǎo)致受體復(fù)合物激活，進(jìn)而導(dǎo)致TβR-II對(duì)TβR-Ⅰ的磷酸化。隨后磷酸化TGF-β信號(hào)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)物Smads(R-Smads)，磷酸化的R-Smads與Smad4相關(guān)聯(lián)，進(jìn)入細(xì)胞核，之后與大量的轉(zhuǎn)錄因子相互作用產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)功能[52-55]。EA對(duì)TGFβ/Smads信號(hào)通路中相關(guān)因子的調(diào)控將直接影響與TGFβ/Smads相關(guān)的細(xì)胞周期。

除了TGFβ/Smads信號(hào)通路，PI3K/Akt(磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B)信號(hào)通路也與細(xì)胞存活和凋亡之間的平衡緊密相關(guān)[56-57]，被認(rèn)為是EA處理結(jié)腸癌細(xì)胞引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)的潛在靶點(diǎn)。EA處理使細(xì)胞在G2/M期停滯，顯著降低活化的PI3K，p-Ak(能滅活前caspase-9，阻斷caspase-9參與的凋亡)，Bcl-2，DNA聚合酶的輔助因子PCNA，細(xì)胞周期蛋白D1的水平，而B(niǎo)ax，cytc及caspase-3表達(dá)的增加，顯示出EA抗增殖作用和細(xì)胞毒性[58]。該信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PI3K和Akt的失活促進(jìn)了與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(caspase，p53等)的表達(dá)，這與許多多酚可調(diào)節(jié)Akt途徑的研究相一致[51，59-60]。目前的研究結(jié)果表明，EA在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面有累加效應(yīng)[61]。

2.4 抗炎作用

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物來(lái)源的次級(jí)代謝產(chǎn)物能夠直接影響炎癥介質(zhì)、第二信使、轉(zhuǎn)錄因子等產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)抗炎作用[64-65]。Alexandre等[15]在卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中研究鞣花酸在過(guò)敏性肺部炎癥中的療效。結(jié)果表明，鞣花酸減少了嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量，抑制了細(xì)胞募集和細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的表達(dá)并呈時(shí)間和劑量依賴性，而且降低了白細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。研究者推測(cè)，由于鞣花酸抑制了激活蛋白1(AP-1)[66]和NF-κB[67]，所以嗜酸性細(xì)胞的招募和細(xì)胞因子的產(chǎn)生才得到抑制。

許多粘附分子在炎癥過(guò)程和免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用[68]，EA對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)作用也在這些方面有所體現(xiàn)[69]在核桃(JuglansregiaL.)中鞣花酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞抗炎效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，在不影響細(xì)胞增殖速率的條件下，由炎性細(xì)胞因子TNF-α激活的血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞粘附分子-1(ICAM-1)在實(shí)驗(yàn)中受到鞣花酸的抑制，這種效應(yīng)可能影響某些疾病的發(fā)生。細(xì)胞粘附分子表達(dá)和活化的增加刺激了白細(xì)胞募集到血管內(nèi)皮中，這是動(dòng)脈硬化發(fā)病機(jī)制中的重要步驟[70]，因此粘附分子是臨床中潛在的治療靶點(diǎn)。而鞣花酸對(duì)粘附分子的抑制現(xiàn)象不僅體現(xiàn)了其抗炎作用，而且為其具有潛在的抗動(dòng)脈硬化能力提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

不僅如此，EA的抗炎作用在組織實(shí)驗(yàn)中也得到了很好的驗(yàn)證。Mohammad等[71]發(fā)現(xiàn)，全身施用EA可以降低一氧化氮(Nitric Oxide，NO)(只降低血清中，對(duì)爪組織中NO無(wú)影響)水平，減少多形核白細(xì)胞遷移到炎癥部位，最終大鼠炎癥爪水腫得到緩解且效果呈劑量依賴性。受到EA抑制的NF-κB引起下路的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，促炎細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β的表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)iNOS的產(chǎn)物NO下降[72]。由于L-精氨酸-NO途徑參與EA對(duì)醋酸引起內(nèi)臟疼痛的鎮(zhèn)痛作用[73]以及EA可通過(guò)下調(diào)iNOS來(lái)抑制NO的釋放[74]，所以推測(cè)這種抗炎作用可能與L-精氨酸-NO途徑受到影響有關(guān)。而MDA和血漿中的AST和ALT酶的降低[71]預(yù)示EA的抗炎作用可能部分歸因于其抗氧化活性。

除此之外，EA還可以減少促炎、促纖維化的細(xì)胞因子(IL-1α，IL-6，IL-8，TNF-α和TGF-β)的表達(dá)，進(jìn)而減少酒精誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)生和纖維的產(chǎn)生[75-76]。

2.5 抗病毒作用

在一些研究中，鞣花酸的抗病毒活性也得以發(fā)現(xiàn)[77-78]。Promsong等[14]研究了鞣花酸對(duì)HIV-1復(fù)制的影響。他們的結(jié)果表明，鞣花酸抑制了HIV-1整合酶的表達(dá)，進(jìn)而抑制了HIV-1的感染。而且不論HIV-1感染前后，鞣花酸都表現(xiàn)出抑制作用，可能意味著鞣花酸可以抑制HIV-1早期和晚期復(fù)制。鑒于抑制整合酶而呈現(xiàn)出顯著的抗HIV-1活性，鞣花酸有望作為新型的抗HIV藥物。

在其它病毒中，EA呈現(xiàn)不同機(jī)制的抗病毒作用。HBx是一種多功能的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)節(jié)劑，參與乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制過(guò)程[79]。Pathak等[80]確定EA抑制病毒復(fù)制時(shí)HBx誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。所以，EA可以降低HBV感染細(xì)胞中HBeAg(一種乙型肝炎病毒蛋白)的分泌[81-82],減少HBeAg在血清中的積累，進(jìn)而阻斷了HBeAg引起的免疫耐受[83]。而在丙型肝炎病毒(HCV)中，非結(jié)構(gòu)蛋白NS3具有解旋酶和NTPase活性，再與輔因子NS4A結(jié)合組成主要的病毒蛋白酶NS3/4A，而NS5B是RNA依賴的RNA聚合酶，參與病毒RNA的復(fù)制。Reddy等[84]和Ajala等[85]證明EA在體外能抑制NS3/4A蛋白酶活性，最終通過(guò)減少NS5B活性和HCV中RNA水平，表現(xiàn)出EA對(duì)HCV的抗病毒作用。

3 結(jié)束語(yǔ)

鞣花酸是一種天然存在的多酚化合物，與石榴等的保健功能密切相關(guān)。鞣花酸的結(jié)構(gòu)功能、理化性質(zhì)等不斷被挖掘，其存在潛在的藥理學(xué)特性一直是研究的熱點(diǎn)。雖然鞣花酸的抗氧化，抗增殖，抗病毒等機(jī)制被揭示，但目前無(wú)法將其投入到疾病治療中，還需要進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)評(píng)估鞣花酸及其代謝物的藥理學(xué)作用。此外，鞣花酸生物利用度低也是阻礙其應(yīng)用的主要問(wèn)題之一，尿石素及其衍生物的開(kāi)發(fā)利用或許有助于改善這一狀況，以鞣花酸為本體修飾產(chǎn)生的衍生物已被用作生物膜形成的理想抑制劑[86]。鞣花酸的生物學(xué)效應(yīng)的研究對(duì)癌癥治療和化學(xué)預(yù)防具有重大意義。相信隨著對(duì)鞣花酸研究的深入，鞣花酸將在疾病治療、美容保健等方面表現(xiàn)出積極作用。