唐簫濛，毛洪波

(1.東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱150040；2.阿城區(qū)林業(yè)局，哈爾濱150300)

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)簡稱Bt，1901年由日本生物學家S. Ishiwata在家蠶中首次發(fā)現(xiàn), 1915年德國Berliner從地中海粉螟幼蟲體內(nèi)分離并命名，1953年Hannay確定蛋白晶體為該菌的主要主要殺蟲成分[1-2]。蘇云金桿菌是一類產(chǎn)生晶體、具有殺蟲活性的芽孢桿菌[2]，因無污染、對人畜相對安全等特點成為目前研究和應(yīng)用最為廣泛的微生物殺蟲劑[3-4]。據(jù)報道，蘇云金芽孢桿菌主要對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目幼蟲具有殺蟲活性，生產(chǎn)實踐中也常用于防治上述農(nóng)林害蟲[5-6]。蘇云金桿菌制劑是依靠被昆蟲取食后δ-內(nèi)毒素在消化系統(tǒng)中與中腸細胞受體結(jié)合導致細胞膨脹解體，同時在這一過程中破壞了細胞間跨膜電勢與酸堿平衡，干擾養(yǎng)分吸收，最終導致昆蟲死亡[7]。近年來對于Bt的研究主要集中在其 δ-內(nèi)毒素方面，包括ICP 基因重組改造、構(gòu)造工程菌，以提高內(nèi)毒素的殺蟲效率，擴大殺蟲譜，延長有效期等[8]。有關(guān)細菌對蚜蟲的作用研究較少，如粘質(zhì)沙雷氏菌(SerratiamarcescensKI 3)和陰溝腸細菌(Enterobactercloacae，KI 63)對蚜蟲均有明顯的殺滅作用[9]；特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)對高粱蚜(Melanaphissacchari)具有57.3%的致死率[10]。但蘇云金芽孢桿菌對蚜蟲毒殺作用和防御酶活性影響的研究尚未見報道。正常情況下，機體通過體內(nèi)的保護酶系維持自由基的代謝平衡[11]，當昆蟲受到農(nóng)藥脅迫之后，昆蟲體內(nèi)會誘發(fā)細胞大量產(chǎn)生各種活性氧物質(zhì)， 而活性氧會導致體內(nèi)的細胞膜脂質(zhì)過氧化、影響細胞內(nèi)的信號傳導和基因表達等多種生理活動[12]。大量研究表明，昆蟲體內(nèi)的保護酶在其適應(yīng)逆境以及抗藥性形成等方面都有直接聯(lián)系，在昆蟲生長發(fā)育、殺蟲劑滲入和病原微生物侵染等情況下發(fā)揮著清除自由基、保護機體免受或減輕傷害的作用[8-13]。本文在測定一株蘇云金桿菌亞種對柳蚜(AphisfarinosaGmelin)具有一定生物活性的基礎(chǔ)上，研究了蘇云金亞種發(fā)酵產(chǎn)物對柳蚜過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)比活力的影響，旨在闡明該株蘇云金桿菌對蚜蟲的毒力及其作用機制，為利用該菌株研制殺蚜劑和生產(chǎn)防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及蟲源

菌株為蘇云金亞種(Bt)由本實驗室分離獲得。柳蚜(AphisfarinosaGmelin)生長于東北林業(yè)大學校實驗林場旱柳嫩枝枝梢上，用于生物測定。

1.2 試劑盒

考馬斯亮藍試劑盒(可見分光光度法)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)，以上試劑盒均選用上海優(yōu)選生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 蘇蕓金桿菌供試菌液的制備

取0.01g菌粉在無菌環(huán)境下用無菌水稀釋107倍，取蘇云金桿菌菌液 0.1mL涂于滅菌LB固體培養(yǎng)基上活化，恒溫28(±1)℃培養(yǎng)24h。然后接種于LB斜面培養(yǎng)基，恒溫28(±1)℃培養(yǎng)24h后接種到液體LB培養(yǎng)基中，28(±1)℃、120r/min震蕩培養(yǎng)48h作為原液備用[14]。將1mL原液稀釋為10-7濃度并取0.1mL涂于固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)恒溫(28±1℃)培養(yǎng)24h，重復3次，進行活孢子計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果將原液配制為100億芽孢/mL的菌液并分為3份備用。一份加無菌水稀釋至200、400、800、1600、3200倍液用于柳蚜生物測定；第二份稀釋800倍后用于針筒式濾膜過濾器過濾(0.2μm孔徑)，去除發(fā)酵液中蘇蕓金桿菌芽孢和伴孢晶體，第三份稀釋至800倍液和經(jīng)過過濾的第二份用于酶活測定。

1.4 生物測定

將稀釋為200、400、800、1600、3200倍的菌液按相同劑量分別均勻噴灑于柳蚜危害的樣枝上，清水為對照組，72h后分別統(tǒng)計各處理柳蚜死亡和存活數(shù)量，并計算死亡率和校正死亡率。

1.5 酶液制備及酶活測定

在室內(nèi)將患蟲病枝去除葉片后水培，取稀釋至800倍的蘇云金芽孢桿菌菌液過濾與無過濾組按相同劑量均勻噴灑至嫩枝柳蚜上，于6、12、18、24、30h分別取活蟲作為樣品，樣品用液氮處理后保存于-80℃冰箱中備用。

取0.1g柳蚜樣品于2mL離心管，與1mL提取液(蒸餾水)混合勻漿，8000g，4℃，離心10min，上清液按上海優(yōu)選生物科技有限公司生產(chǎn)的考馬斯亮藍試劑盒對選取樣本的蛋白含量測定。通過計算出的蛋白含量計算過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)酶比活力。3種保護酶比活力計算公式如下：

SOD：

抑制百分率=(A對照管-A測定管)÷A對照管×100%

SOD活性(U/mg protein)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(V樣×Cpr)×樣本稀釋倍數(shù)

注：V反總：反應(yīng)體系總體系，1.026mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.09mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL。

CAT：

CAT(U/mg protein)=[△A×V反總÷(Σ×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T

注：V反總：反應(yīng)體系總體系，1.035×10-3L；Σ：H2O2摩爾消光系數(shù)，4.36×104L/mol/cm；V樣：加入樣本體積，0.035mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時間，1min。

POD：

POD(U/mg protein)=△A×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.01÷T

注：V反總：反應(yīng)體系總體積，1.07mL；V樣；加入樣本體積，0.015mL；T：反應(yīng)時間，1min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

1.6 數(shù)據(jù)處理

每組處理3次重復，試驗結(jié)果以“平均值±標準誤(SE)”表示。生物測定數(shù)據(jù)采用EXCEL和SPSS 17.0軟件求出LD50并進行t-檢驗和單因素方差分析，并用p<0.05 為可接受的顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘇云金亞種液體發(fā)酵產(chǎn)物對柳蚜的毒力測定

表1 蘇云金亞種液體發(fā)酵產(chǎn)物對柳蚜的毒力測定結(jié)果

利用蘇云金桿菌蘇云金亞種液體發(fā)酵產(chǎn)物的不同稀釋液噴灑處理柳蚜危害枝條，72h每處理隨機統(tǒng)計500頭蚜蟲，其死亡率及校正死亡率見表 1。200倍液、400倍液和 800倍液校正死亡率均達 50%以上，其中200倍液死亡率、校正死亡率分別為80.40%和78.88%，且3濃度校正死亡率之間差異顯著(p<0.05)。而1600 倍液、3200倍液校正死亡率分別為40.09%和29.74%。

2.2 蘇云金亞種發(fā)酵產(chǎn)物處理與柳蚜3種保護酶比活力的關(guān)系

2.2.1 對超氧化物歧化酶(SOD)比活力的影響

圖1 蘇云金桿菌對柳蚜超氧化物歧化酶(SOD)比活力的影響

注：在黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(U/mg protein)，CK 為對照組、A1 為過濾組、A2為無過濾組。

利用蘇云金亞種發(fā)酵液和發(fā)酵液濾液處理柳蚜，清水處理為對照，并在5個時間點取樣、測定柳蚜超氧化物歧化酶(SOD)活力。圖1結(jié)果顯示，6h 3處理間柳蚜超氧化物氣化酶(SOD)比活力無顯著差異(p<0.05)12～30h蘇云金亞種發(fā)酵液處理組柳蚜SOD的比活力均低于對照,且18h、24h SOD的比活力顯著低于對照(p<0.05)，其柳蚜SOD比活力分別比對照低38.11%和26.31%，但30h SOD比活力顯著高于對照。蘇云金亞種發(fā)酵液濾液處理組12～24h柳蚜SOD的比活力均顯著低于對照(p<0.05)，其柳蚜SOD比活力比對照低4.69%～36.79%，且呈逐漸升高的趨勢，蘇云金亞種發(fā)酵液和發(fā)酵液濾液均能抑制柳蚜SOD的比活力(除濾液處理組30h)，從而影響柳蚜正常的新陳代謝。

2.2.2 對柳蚜過氧化氫酶(CAT)比活力的影響

圖2 蘇云金桿菌對柳蚜過氧化氫酶(CAT)比活力的影響

注：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位，CK 為對照組、A1 為過濾組、A2為無過濾組。

圖2顯示，利用蘇云金亞種發(fā)酵液和發(fā)酵液濾液處理后，柳蚜過氧化氫酶(CAT)比活力均呈先升后降的趨勢，但發(fā)酵液處理組和濾液處理組CAT活力高峰分別出現(xiàn)在12h和18h，其CAT比活力分別比對照高88.89%和194.63%。發(fā)酵液處理組12h、18h CAT比活力顯著高于對照(p<0.05)，24h顯著低于對照(p<0.05)，其比活力僅為對照的52.07%；濾液處理組6h、18h 和30hCAT比活力顯著高于對照(p<0.05)，其比活力分別為對照的1.8657倍、2.9463倍和1.6597倍，24h顯著低于對照(p<0.05)，其比活力比對照低30.48%。發(fā)酵液和濾液處理18h前對 CAT的比活力總體呈激活作用，兩者對柳蚜CAT比活力的影響趨勢基本相同，但在時間點上有所不同。

2.2.3 對柳蚜氧化物酶(POD)比活力的影響

圖3 蘇云金桿菌對柳蚜過氧化物酶(POD)比活力的影響

注：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位，CK 為對照組、A1 為過濾組、A2為無過濾組。

蘇云金亞種發(fā)酵液和濾液對柳蚜氧化物酶比活力(POD)的影響見圖3。蘇云金亞種濾液處理組柳蚜過氧化物酶(POD)比活力呈先升后降的趨勢，而發(fā)酵液組柳蚜過氧化物酶(POD)比活力呈升-降-升-降的趨勢，濾液和發(fā)酵液處理組POD比活力高峰分別出現(xiàn)在12h和18h。濾液處理組對POD比活力總體呈激活作用，其激活率為14.78%～57.39%；而發(fā)酵液處理組6h和18h POD比活力顯著高于對照(p<0.05)，分別為對照的1.4867倍和1.7982倍，其他時間點POD比活力與對照無顯著差異。

3 結(jié)論與討論

蚜蟲做為多種主要農(nóng)林植物的嚴重主要害蟲，其發(fā)育周期短、繁殖速率快、生活隱蔽、吸食植物汁液，常常造成嚴重的經(jīng)濟損失嚴重[15-16]。對該類害蟲的防治多以化學防治為主，不僅造成環(huán)境污染和殘留、還易再度猖獗[17-18]。本研究以蘇云金桿菌蘇云金亞種發(fā)酵產(chǎn)物為材料，5種濃度的稀釋液對柳蚜的致死率達29.74%～78.88%，其200倍液處理柳蚜校正死亡率與粘質(zhì)沙雷氏菌(KI 3)和陰溝腸細菌(KI 63)對油菜(Brassicasp．)蚜蟲防治效果相近[9]，顯著高于特基拉芽孢桿菌(RA1402)對高粱蚜蟲的致死率(57.3%)，是一株對柳蚜具有較高毒力的生防微生物。蘇蕓金桿菌類發(fā)酵簡單、成本低廉、殺蟲譜廣、環(huán)境友好，是目前廣泛應(yīng)用的微生物殺蟲劑。該蘇云金亞種對柳蚜顯示一定的生物活性，是一株具有研究價值和應(yīng)用前景的生防細菌，但殺蚜組分及其致病機制有待進一步研究。

昆蟲體內(nèi)的超氧化物歧化酶( SOD)、過氧化氫酶( CAT)和過氧化物酶( POD)等保護酶在對體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除種起著重要作用，是防御氧化損傷的重要酶類[19]。蔣志勝等[20]α-三噻吩處理菜青蟲(Pierisrapae) 后使超氧化物歧化酶失活，且有效抑制淡色庫蚊(Culexpipienspallens) SOD、POD 和 CAT 比活力，使昆蟲無法及時清除蟲體產(chǎn)生的超氧陰離子等活性。本研究表明，蘇云金亞種發(fā)酵液和發(fā)酵液濾液處理柳蚜后，其體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性6h與對照無顯著差異，隨脅迫時間的延長SOD比活力受到明顯抑制，其12～24h抑制率達顯著水平，30h恢復正常。柳蚜經(jīng)發(fā)酵液和發(fā)酵液濾液處理過氧化氫酶(CAT)比活力均先升后降，除24h 外CAT比活力均高于對照，兩處理對柳蚜CAT比活力總體呈激活作用，這與牛宇等[21]利用白僵菌(Beauveriabassiana)處理油松毛蟲(Dendrolimustabulaeformis)幼蟲后過氧化氫酶(CAT)活性變化趨勢相似。蘇云金亞種發(fā)酵液和濾液對柳蚜氧化物酶活性(POD)的激活速率存在差異，POD活力高峰分別出現(xiàn)在12h和18h，但兩者對POD活性總體呈激活作用。由于蘇云金亞種發(fā)酵液和發(fā)酵液濾液的脅迫，柳蚜體內(nèi)的SOD、CAT和 POD的比活力均受到不同程度的影響，擾亂了自身的抗氧化作用，導致蟲體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間失去了平衡，自身防衛(wèi)能力下降。