劉 瑩 瑩， 王 大 鷙， 張 紹 印

( 大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

過氧化氫酶具有催化專一、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，在工業(yè)領(lǐng)域都具有較廣泛的應(yīng)用[1-3]。游離酶穩(wěn)定性差，對環(huán)境變化十分敏感，難以重復(fù)使用，反應(yīng)后產(chǎn)物的分離、純化以及酶的回收都非常困難，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，在一定程度上限制了過氧化氫酶的工業(yè)應(yīng)用。將酶固定在合適的載體上可能會解決上述問題[4]。因此，對酶的固定化研究是酶工程研究的核心內(nèi)容之一。國內(nèi)外研究學(xué)者對于過氧化氫酶的固定化已經(jīng)做了大量的研究。陳爽等[5]用Fe(Ⅲ)改性膠原蛋白固定化過氧化氫酶，固定化酶重復(fù)性較好，重復(fù)使用25次仍能保持50%的相對酶活力，但由于膠原蛋白不易保存等缺點(diǎn)，還未見大批量的工業(yè)化應(yīng)用。

聚芳醚砜[6]作為固定化酶載體的優(yōu)點(diǎn)在于性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸、堿，多孔等，此外，聚芳醚砜具有多種功能基團(tuán)，如—COOH、—NH2、—SO3H等，這些基團(tuán)都可幫助載體固定酶。聚芳醚砜載體由含羧基的可再生資源雙酚酸制備，不僅成本低、易于分離，而且聚合物引入的羧基與酶的非活性位點(diǎn)有良好的吸附性。課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)含羧酸鈉基功能性基團(tuán)[7]的聚芳醚砜(PAES-C-Na)對單一的金屬離子具有優(yōu)異的吸附性能。本實(shí)驗(yàn)對聚芳醚砜通過PVPK90改性，吸附金屬離子，再固定吸附酶，并對固定化酶和游離酶的活性進(jìn)行了對比研究。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

聚芳醚砜，實(shí)驗(yàn)室自制；過氧化氫酶；硫酸銅、二甲基亞砜、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、30%過氧化氫，分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚芳醚砜載體改性

一定量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與聚芳醚砜置于250 mL錐形瓶中，加入適量的二甲基亞砜，加熱溶解后滴進(jìn)熱水中，形成球狀固體，并于沸水中反復(fù)煮6～7次，最后在100 ℃條件下真空干燥12 h以上。制成多孔載體后吸附Cu2+，即得到改性后的聚芳醚砜多孔載體。

1.2.2 改性后的聚芳醚砜載體固定過氧化氫酶

將50.0 mg改性后的聚芳醚砜多孔載體置于5 mL體積分?jǐn)?shù)為0.25 mL/mL的過氧化氫酶液中，150 r/min搖床反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗3～4次以除去多余的酶液，得到以聚芳醚砜為載體的固定化過氧化氫酶[8]。

1.3 分析方法

1.3.1 游離過氧化氫酶的酶活力測定

采用分光光度法[9]于25 ℃測定游離過氧化氫的酶活。反應(yīng)液總體積為3 mL，含0.1 mL酶液和2.9 mL含有1 mol/L H2O2的50 mmol/L的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH 7.0)，在過氧化氫特征吸收波長240 nm處測定吸光度變化。過氧化氫酶的酶活力定義為：25 ℃時每分鐘分解1 μmol H2O2所需的酶量。

1.3.2 固定化過氧化氫酶的酶活力測定

準(zhǔn)確稱取100.0 mg固定化過氧化氫酶加到1 mol/L H2O2的50 mmol/L的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH 7.0)中，反應(yīng)1 min后過濾取出固定化酶，在過氧化氫特征吸收波長240 nm 處測定吸光度變化，求得固定化酶活。

1.3.3 固定化過氧化氫酶回收率及吸附率

固定化過氧化氫酶回收率和吸附率按公式計(jì)算[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化酶的最適反應(yīng)溫度

將制備的固定化過氧化氫酶和游離酶分別置于pH為7.0磷酸鹽緩沖溶液配置的0.1 mol/L H2O2溶液中，在不同溫度下保存10 min，測定酶活力，結(jié)果如圖1所示。固定化過氧化氫酶較游離酶表現(xiàn)出了更高的相對酶活力，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃ 時，固定化酶仍可保持原有酶活力的90%以上，而游離酶到了50 ℃酶活力明顯下降。過氧化氫酶固定化后對溫度的敏感性降低，并可在更廣泛的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)有較高的催化活力。

圖1 游離酶及固定化酶的最適反應(yīng)溫度

2.2 固定化酶的最適反應(yīng)pH

將制備的固定化過氧化氫酶和游離酶分別置于pH為7.0磷酸鹽緩沖溶液配置的0.1 mol/L H2O2溶液中，在35 ℃保存10 min，測定酶活力，結(jié)果如圖2所示。固定化過氧化氫酶在所考察的pH范圍內(nèi)較游離酶表現(xiàn)出了更高的相對酶活力，當(dāng)pH在5.0～9.0內(nèi)，固定化酶與游離酶都表現(xiàn)出了較好的酶活力，酶活力都在90%以上。過氧化氫酶固定化后可在較寬泛的pH范圍內(nèi)應(yīng)用，并且表現(xiàn)出較高的催化活力。

圖2 游離酶及固定化酶的最適反應(yīng)pH

2.3 固定化酶的酸堿穩(wěn)定性

將制備的固定化過氧化氫酶置于不同pH(5.0～9.0)的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫保存5 h，測定酶活力。在同等條件下測定游離酶的pH穩(wěn)定性作為對照，結(jié)果如圖3所示。固定化過氧化氫酶和游離酶在不同pH下保存相同時間，固定化過氧化氫酶表現(xiàn)出了更好的pH穩(wěn)定性，固定化過氧化氫酶在酸、堿條件下依舊能保持80%以上的原有酶活力，而游離酶在酸、堿條件下酶活都低于40%。過氧化氫酶經(jīng)固定化后，更耐酸、堿，大大提高其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。

圖3 游離酶及固定化酶的酸堿穩(wěn)定性

2.4 固定化酶的熱穩(wěn)定性

將制備的固定化過氧化氫酶置于不同pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，在35和55 ℃下保存30、60、90、120 min后，測定固定化酶在低溫、高溫保存不同時間的活力變化。在同等條件下測定游離酶的熱穩(wěn)定性作為對照。由表1可見，在考察的兩個不同溫度并保存不同時間下，固定化過氧化氫酶表現(xiàn)出了更高的熱穩(wěn)定性。

表1 游離酶及固定化酶在35 和55 ℃的熱穩(wěn)定性

2.5 固定化酶的貯藏穩(wěn)定性

在考察固定化過氧化氫的貯藏穩(wěn)定性時，將制備的固定化過氧化氫酶置于空氣中，另取等量游離酶溶于pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，分別放置在4和25 ℃下保存28 d，每隔7 d測其酶活力，結(jié)果如表2所示。由表2可見，固定化過氧化氫酶表現(xiàn)出了更好的貯藏穩(wěn)定性。固定化酶在4 ℃貯藏保存時間更久，相對酶活力更高，在第28天仍能保持60%左右酶活力，游離酶相對酶活力僅有20%。固化酶在25 ℃保存第28天也有30%左右酶活力，游離酶幾乎在第21天就已完全失活。這說明無論在低溫或是室溫條件下，固定化酶都比游離酶有更穩(wěn)定的貯藏穩(wěn)定性。

表2 游離酶及固定化酶在4和25 ℃的貯藏穩(wěn)定性

2.6 固定化酶的重復(fù)使用性

將改性的聚芳醚砜載體分別吸附金屬離子和過氧化氫酶，制備好的固定化過氧化氫酶分別置于35 ℃水浴搖床中，通過測量過氧化氫吸光度計(jì)算酶活力變化，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)改性的聚芳醚砜載體連續(xù)催化過氧化氫分解反應(yīng)20次后，酶活力仍可保持在50%左右，前10次的反應(yīng)中酶活力無明顯下降，直至完全失活可連續(xù)反應(yīng)25次以上，顯示出了該固定化酶良好的重復(fù)使用性，并且載體可回收重復(fù)固定化酶，不會造成載體損失。

圖4 固定化酶的重復(fù)使用性

2.7 固定化酶的二次重復(fù)使用性

將重復(fù)使用過25次后的載體再次重復(fù)固定化步驟，即分別吸附金屬離子和過氧化氫酶酶，將制備好的固定化過氧化氫酶分別置于35 ℃水浴搖床中，通過測量過氧化氫酶吸光度計(jì)算酶活力變化。由圖5可見，載體經(jīng)使用了25次后，再次固定過氧化氫酶仍可表現(xiàn)出良好的重復(fù)使用性，其中，先吸附金屬離子再固定化酶的方法比只固定化酶的方法表現(xiàn)出更好的重復(fù)使用性。連續(xù)催化過氧化氫分解反應(yīng)20次后，酶活力仍可保持在50%左右，前10次的反應(yīng)中酶活力無明顯下降，直至完全失活可連續(xù)反應(yīng)25次以上，和第一次重復(fù)使用性幾乎沒有差別，進(jìn)一步說明了載體不會損失，表現(xiàn)出較好的重復(fù)使用性。

圖5 固定化酶的二次重復(fù)使用性

3 結(jié) 論

聚芳醚砜具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、耐酸堿、耐高溫等優(yōu)良性質(zhì)。Cu(Ⅱ)作用改性后的聚芳醚砜為載體固定過氧化氫酶，使得該載體使用周期大大增強(qiáng)。過氧化氫酶經(jīng)此方法固定后表現(xiàn)出了良好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性以及貯藏穩(wěn)定性。固定化酶的反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度適用范圍均有明顯的提高。值得注意的是，與其他固定化過氧化氫酶載體相比較，以Cu(Ⅱ)作用改性后的聚芳醚砜為載體有更好的操作穩(wěn)定性，且酶活吸附率和酶活回收率都大大提高。