陳 久 梁， 葉 淑 紅， 郭 磊

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.中華人民共和國大窯灣海關(guān)， 遼寧 大連 116601 )

0 引 言

植物內(nèi)生菌是指生活在健康植物組織或細(xì)胞內(nèi)并對(duì)宿主植物不引起明顯病害癥狀的一類微生物群[1]。植物內(nèi)生菌是一個(gè)新的、巨大的微生物資源庫，對(duì)其研究對(duì)農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域都有著重要意義[2]。細(xì)菌胞外多糖(EPS)是一種主要參與細(xì)胞黏附和保護(hù)的多糖，它或與細(xì)胞表面以囊狀共價(jià)結(jié)合，或分泌到細(xì)胞外環(huán)境中。由于其結(jié)構(gòu)和功能特性的多樣，EPS被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域中[3]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌與宿主的“協(xié)同進(jìn)化”關(guān)系決定了某些內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)的能力，具有一定的生物活性。向達(dá)兵等[4]發(fā)現(xiàn)苦蕎植株中分離出的內(nèi)生真菌，經(jīng)其多糖處理的苦蕎苗的質(zhì)量、葉面積、莖粗及葉綠素含量均顯著增加，植株更加健壯；華棟[5]研究發(fā)現(xiàn)綠絨蒿內(nèi)生真菌多糖擁有一定的抗氧化活性。微生物在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中往往會(huì)面對(duì)諸多逆境脅迫。為保護(hù)自身，生物體在逆境環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生多種應(yīng)激反應(yīng)和生理特性變化[6-7]。研究微生物在逆境下的活性代謝產(chǎn)物變化對(duì)于微生物應(yīng)用、誘導(dǎo)新型化合物的產(chǎn)生等具有重要意義。

菌株LysinibacillussphaericusYa6是從健康的銀杏葉芽中分離并經(jīng)過初步篩選后得到的銀杏內(nèi)生菌，經(jīng)鑒定，為球形賴氨酸芽孢桿菌(GenBank號(hào)KY565423.1)。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其可在堿性條件下生長(zhǎng)，當(dāng)pH為10時(shí)，生長(zhǎng)開始出現(xiàn)明顯減慢。本實(shí)驗(yàn)研究了在不同程度堿脅迫下內(nèi)生菌LysinibacillussphaericusYa6胞外多糖的結(jié)構(gòu)和生理特性變化。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)菌株LysinibacillussphaericusYa6，從大連工業(yè)大學(xué)校園內(nèi)銀杏樹中分離得到一株植物內(nèi)生菌，由本實(shí)驗(yàn)室純化并保藏。采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，葡萄糖0.5%，pH 7.2～7.4)進(jìn)行活化。發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗糖120 g/L，酵母浸粉8 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，氯化鉀1 g/L，pH分別為8、9、10。

1.2 方 法

1.2.1 胞外多糖的提取與純化

菌株接入活化培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)18 h后以2%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃搖瓶培養(yǎng)18 h(轉(zhuǎn)接兩次)。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用無菌水調(diào)整菌液OD600為0.8，以2%的接種量接種于相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃搖瓶培養(yǎng)54 h后進(jìn)行巴氏滅菌。發(fā)酵液于8 000 r/min離心15 min，收集上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以使其濃縮后加入4倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜。離心收集沉淀的胞外多糖(EPS)加適量去離子水溶解，用Sevag法去除蛋白。將經(jīng)過脫蛋白處理的EPS溶液裝入透析袋中，截留分子質(zhì)量8～14 ku的蛋白；自來水流水透析48 h后蒸餾水透析48 h。將透析后的溶液8 000 r/min離心15 min去除沉淀，濃縮、冷凍干燥得到粗EPS。

用DEAE-52纖維素和Sephadex G-100凝膠對(duì)EPS進(jìn)行純化。將洗脫液濃縮、透析、凍干，得到純化后的EPS，分別命名為EPSoc、EPS8、EPS9、EPS10

1.2.2 超氧陰離子清除率測(cè)定

將0.05 mol/L的Tris-HCL緩沖液(pH=8.2)和7 mmol/L的焦性沒食子酸溶液于25 ℃水浴預(yù)熱20 min。分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL不同質(zhì)量濃度的樣液1 mL，加入Tris-HCL緩沖液4.5 mL和焦性沒食子酸溶液0.4 mL?；旌象w系于25 ℃精確反應(yīng)4 min后滴加2滴10 mol/L濃鹽酸終止反應(yīng)。在320 nm處測(cè)定吸光度，用蒸餾水代替焦性沒食子酸溶液作對(duì)照組，用蒸餾水代替樣品溶液作空白組，用抗壞血酸溶液代替樣品溶液作為陽性對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取平均值[8]。

樣品對(duì)超氧陰離子的清除率按照式(1)計(jì)算：

清除率=[1-(A0-A1)/A2]×100%

(1)

式中：A0、A1、A2分別為樣品組、對(duì)照組、空白組在320 nm處的吸光度。

1.2.3 羥自由基清除率測(cè)定

分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL不同質(zhì)量濃度的樣液1 mL，加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL和8.8 mmol/L過氧化氫溶液1 mL。反應(yīng)體系混合均勻后于37 ℃下反應(yīng)30 min。在510 nm處測(cè)定吸光度，用蒸餾水代替過氧化氫溶液作為對(duì)照組，用蒸餾水代替樣品溶液作為空白組，用抗壞血酸溶液代替樣品溶液作為陽性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取平均值[9]。

樣品對(duì)羥自由基的清除率按照式(2)計(jì)算：

清除率=[1-(A′0-A′1)/A′2]×100%

(2)

式中：A′0、A′1、A′2分別為樣品組、對(duì)照組、空白組在510 nm處的吸光度。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測(cè)定

分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL不同質(zhì)量濃度的樣液2 mL，加入0.26 μmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL。該反應(yīng)體系混合均勻后避光反應(yīng)30 min。在517 nm處測(cè)定吸光度，用無水乙醇代替DPPH溶液作為對(duì)照組，用無水乙醇代替樣品溶液作為空白組，用抗壞血酸溶液代替樣品溶液作為陽性對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取平均值[10]。

樣品對(duì)DPPH自由基的清除率按照式(3)計(jì)算：

清除率=[1-(A″0-A″1)/A″2]×100%

(3)

式中：A″0、A″1、A″2分別為樣品組、對(duì)照組、空白組在517 nm處的吸光度。

1.2.5 紫外光譜分析

將純化后的EPS樣品配制成0.1 mg/mL的溶液，用紫外可見分光光度計(jì)在190～400 nm進(jìn)行掃描。

1.2.6 紅外光譜分析

將純化后的EPS樣品分別與KBr粉末混合研磨，用壓片機(jī)壓制成片，在4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描。

1.2.7 硫酸根含量的測(cè)定

采用硫酸鋇比濁法測(cè)定樣品中硫酸根的含量。分別配制質(zhì)量濃度0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的硫酸鉀溶液。稱取明膠0.25 g，用少量熱水溶解后定容至50 mL，4 ℃靜置過夜后加入0.25 g氯化鋇，4 ℃保存。分別取各濃度硫酸鉀溶液2 mL，加入3 mL氯化鋇-明膠水溶液，混合均勻后于360 nm測(cè)定吸光度。以硫酸鉀濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到回歸方程。

稱取EPS 2 mg，與2 mol/L三氟乙酸2 mL一起注入安瓿，充入保護(hù)性氣體后用酒精噴燈加熱密封，于110 ℃烘箱內(nèi)水解2 h。取反應(yīng)后混合物2 mL測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品的硫酸根含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 超氧陰離子清除率

樣品清除超氧陰離子生成的能力如圖1所示，以在最適條件下培養(yǎng)菌株所得的胞外多糖為對(duì)照，以抗壞血酸(VC)為陽性對(duì)照。從圖1可以看出，超氧陰離子清除率與多糖濃度有一定的濃度依賴性。在堿脅迫時(shí)，與其他樣品相比，EPS10在1.0～2.5 mg/mL超氧陰離子清除率最強(qiáng)，在質(zhì)量濃度2.5 mg/mL時(shí)，其超氧陰離子清除率達(dá)到35.59%。EPS8和EPS9在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)的超氧陰離子清除率也超過了EPSoc，分別達(dá)到了29.72%和28.92%。EPSoc、EPS8、EPS9、EPS10清除超氧陰離子的EC50分別為11.224、10.720、5.926、3.790 mg/mL。

圖1 堿脅迫條件下Lysinibacillus sphaericus Ya6所產(chǎn)胞外多糖的超氧陰離子清除能力

2.2 羥自由基清除率

樣品的羥自由基清除能力如圖2所示。以在最適條件下培養(yǎng)菌株所得的胞外多糖為對(duì)照，以抗壞血酸(VC)為陽性對(duì)照。由圖2可知，菌株在堿脅迫條件下菌株產(chǎn)胞外多糖的羥自由基清除能力遠(yuǎn)低于抗壞血酸，但強(qiáng)于最適條件下產(chǎn)胞外多糖的羥自由基清除能力。其中EPS10羥自由基清除能力最強(qiáng)。EPSoc、EPS8、EPS9、EPS10清除羥自由基的EC50分別為28.171、21.479、25.192、26.536 mg/mL。

圖2 堿脅迫條件下Lysinibacillus sphaericusYa6產(chǎn)胞外多糖的羥自由基清除能力

2.3 DPPH自由基清除率

樣品的DPPH自由基清除能力如圖3所示。以最適條件下培養(yǎng)菌株所得的胞外多糖為對(duì)照，以抗壞血酸(VC)為陽性對(duì)照。如圖3所示，在堿脅迫條件下，菌株所產(chǎn)的胞外多糖表現(xiàn)出了較強(qiáng)的DPPH自由基清除活力，在0.5～2.5 mg/mL，各實(shí)驗(yàn)組樣品的DPPH自由基清除能力均強(qiáng)于對(duì)照組，其中EPS10的DPPH自由基清除能力最佳，在質(zhì)量濃度2.5 mg/mL時(shí)達(dá)到95.65%。EPSoc、EPS8、EPS9、EPS10清除DPPH自由基的EC50分別為2.975、0.996、0.936、0.903 mg/mL。

圖3 堿脅迫條件下Lysinibacillus sphaericusYa6所產(chǎn)胞外多糖的DPPH清除能力

2.4 紫外光譜分析

各樣品在190～400 nm的掃描結(jié)果如圖4所示。各樣品在260和280 nm處無紫外吸收，表明樣品中不含核酸和蛋白質(zhì)[11]。

圖4 堿脅迫下Lysinibacillus sphaericus Ya6產(chǎn)胞外多糖的紫外掃描光譜

2.5 紅外光譜分析

圖5 堿脅迫下Lysinibacillus sphaericus Ya6產(chǎn)胞外多糖的紅外掃描光譜

本實(shí)驗(yàn)各樣品的紅外光譜大體相似，均出現(xiàn)了典型的多糖特征吸收峰，且存在甘露糖-吡喃糖結(jié)構(gòu)，但吸收峰強(qiáng)度、位置存在差異，說明它們的成分含量不同。

2.6 硫酸根含量

EPS各樣品中的硫酸根含量如表1所示。

表1 EPS中硫酸根的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

在堿脅迫條件下，菌株所產(chǎn)胞外多糖的硫酸根含量隨培養(yǎng)基pH的升高而增加。研究表明，硫酸多糖具有良好的DPPH自由基清除能力[18-20]。這與本研究得出的結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

堿脅迫使LysinibacillussphaericusYa6產(chǎn)胞外多糖對(duì)超氧陰離子、羥自由基的清除能力有所提升；對(duì)DPPH自由基清除能力顯著提升，pH為10時(shí)，胞外多糖的DPPH自由基清除率高達(dá)95.65%。紫外光譜分析發(fā)現(xiàn)各樣品在260和280 nm處無紫外吸收，表明樣品中不含核酸和蛋白質(zhì)；紅外光譜分析表明各多糖樣品均存在典型的多糖特征吸收峰，且存在甘露糖-吡喃糖結(jié)構(gòu)，但吸收峰強(qiáng)度、位置存在差異。菌株所產(chǎn)胞外多糖的硫酸根含量隨培養(yǎng)基pH的升高而增加。