詹舒儀，黃露露，龍思齊，周雅倩，雷文枚，婁 崢

缺血性腦卒中是臨床常見心腦血管疾病，其病因通常是由于血栓形成、血管畸形造成局部腦組織缺血缺氧而導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡、壞死。現(xiàn)階段治療方法一般采用組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，t-PA)進行溶栓治療，使組織盡快恢復(fù)供血，部分患者在使用上述治療方法后會出現(xiàn)病情加重的結(jié)果，稱為缺血/再灌注損傷，其中再灌注損傷甚至超過了缺血損傷。缺血/再灌注損傷涉及機制較為復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)興奮性毒性等方面[1]，而氧化應(yīng)激又是學(xué)界的研究熱點。

丹參作為我國傳統(tǒng)中藥，具有活血通絡(luò)、清心除煩的廣泛作用，丹參多酚酸鹽是丹參的水溶性提取物，其中主要成分為丹參乙酸鎂[2]。現(xiàn)代研究認為丹參乙酸鎂可以通過抑制血小板激活來抑制血栓形成，同時具有良好的抗氧化作用，丹參多酚酸鹽注射液現(xiàn)階段已經(jīng)成為心肌缺血的輔助用藥，已有使用丹參多酚酸鹽用于缺血性腦卒中治療的循證醫(yī)學(xué)研究[3]，而我們前期研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽/丹參乙酸鎂可以用于腦缺血/再灌注的氧化應(yīng)激損傷，保護神經(jīng)細胞，維持正常生理功能，該作用與抑制中樞系統(tǒng)內(nèi)NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)水平有關(guān)[4-5]。但NOX上游調(diào)節(jié)機制并不十分清楚，本研究擬探討丹參乙酸鎂通過轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)途徑對腦缺血/再灌注損傷的保護作用及其機制，為臨床使用丹參乙酸鎂治療缺血性腦卒中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性清潔級SD大鼠，體重250～300 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[動物合格證號：SCXK(湘)2011-0003]。實驗儀器：Western Blot裝置(美國Bio-Rad公司)，7500 Real-time PCR儀(美國ABI公司)，多功能酶標儀(美國Beckman公司)，ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。實驗試劑：丹參乙酸鎂(上海綠谷制藥股份有限公司)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC，南京建成生物工程研究所)，NOX活性試劑盒(杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本Takara公司)，pSMAD2、pSMAD3、ALK5兔抗體(美國Santa Cruz公司)，TGF-β1 ELISA試劑盒(英國Abcam公司)，H2O2檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 方法 構(gòu)建線栓法腦缺血/再灌注模型[4-5]：10%水合氯醛腹腔麻醉實驗動物后，暴露并分離左側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)，頸外動脈(external carotid artery,ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)。結(jié)扎CCA近心端及ECA，用動脈夾暫時夾閉ICA。于CCA遠心端放置一打好結(jié)的備用絲線，在此線下端剪一小口，將MCAO栓線(北京沙東生物技術(shù)有限公司，栓線頭部直徑為0.40±0.02 mm)插入至ICA，收緊絲線，放開ICA上的動脈夾，順I(yè)CA將栓線送至顱內(nèi)，從CCA分叉處算起，插入深度為約20 mm。阻斷血流2 h后，栓線取出以實現(xiàn)再灌注，同時將備用線結(jié)扎CCA遠心端，并縫好皮膚，再灌注24 h后處理動物。

32只SD大鼠按數(shù)法隨機平均分為4組：假手術(shù)組(sham組)，分離出CCA、ECA和ICA，不插入栓線；腦缺血/再灌注組(I/R組)，缺血2 h，再灌注24 h；腦缺血/再灌注+丹參乙酸鎂組(I/R+MLB組)，再灌注后30 min舌下靜脈給藥(用量：20 mg/kg 0.9% NaCl溶解)；腦缺血/再灌注+溶媒組(I/R+vehicle組)，再灌注后30 min舌下靜脈給藥0.9%NaCl溶液。

1.3 神經(jīng)功能評分 參照Longa等[6]的五級4分評分并改進的方法，待大鼠清醒后由多名實驗人員進行神經(jīng)功能評分。0分：無神經(jīng)缺損癥狀；1分：對側(cè)前肢屈曲、不能伸直、同側(cè)霍納征，表現(xiàn)出提頸時左上肢向下、不能上抬；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。1～4分為有效模型。評分為1～3分納入實驗動物，小于1分的動物舍棄。符合評分但有蛛網(wǎng)膜下腔出血、麻醉后未清醒及術(shù)后死亡作為缺失值，予以剔除。因上述因素導(dǎo)致各實驗組動物數(shù)不足者，則隨時補齊動物數(shù)并重復(fù)實驗，如出現(xiàn)評分分歧，取評分高分。

1.4 梗死體積檢測 再灌注24 h后用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速將腦取出，去掉嗅球及后腦，從額極開始切取4張冠狀腦片，厚約2.0 mm，立刻置于1% TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min，期間翻動腦片2～3次使染色均勻。最后用10%多聚甲醛溶液浸泡固定24 h，將每組腦片排列整齊后進行掃描。再應(yīng)用圖像處理軟件Image J測出各區(qū)腦梗死面積，根據(jù)公式：梗死體積=[(各片正面梗死面積之和+各片反面梗死面積之和)/2]×每片厚度，同樣方法計算出全腦體積。

1.5 TGF-β1水平檢測 應(yīng)用雙抗體夾心法測定TGF-β1水平。用純化的大鼠轉(zhuǎn)化TGF-β1抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入TGF-β1，再與辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的TGF-β1抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色。按TGF-β1 ELISA試劑盒說明書進行實驗操作。

1.6 ALK5 mRNA水平檢測 利用熒光定量實時PCR儀進行反應(yīng)。按照Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒步驟擴增目的基因片段。Real-time PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60 ℃退火和延伸31 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)完成后，接著運行溶解曲線程序，檢測擴增產(chǎn)物特異性，用7500 System SDS軟件分析數(shù)據(jù)。激活素受體激酶5(activin receptor-like kinase 5,ALK5)引物序列為：上游引物序列5′-TTGTTGAGGAGAAGCTGAGGC-3′、下游引物序列5′-CACTGTAATGCCTTCGCCCC-3′。

1.7 蛋白水平檢測 凝膠上樣孔每孔加40～50 μg變性好的蛋白，裝配好垂直電泳裝置，置電泳緩沖液中恒壓80 V電泳約30 min，待樣品進入分離膠后，恒壓120 V，待溴酚藍到達底部時結(jié)束電泳。把電泳后的凝膠放在聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，252 mA恒定轉(zhuǎn)膜2 h。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF放入含有5%的脫脂奶粉的三乙醇胺緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)中，37 ℃搖床封閉1 h；用TBST將牛奶洗掉，一抗4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min；室溫搖床孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；將高靈敏的BeyoECL Plus發(fā)光劑加到PVDF膜的正面，采用ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進行拍照分析，并利用Image Lab軟件進行灰度值分析。

1.9 H2O2水平檢測 H2O2是NOX下游的重要氧化物，也是造成細胞損傷的重要活性氧。按廠家提供標準品制備標準曲線，在將腦組織勻漿液和NG108-15神經(jīng)細胞裂解液與試劑盒工作液反應(yīng)，于酶標儀540 nm檢測吸光度值，再根據(jù)標準曲線計算出樣品中H2O2水平。

2 結(jié)果

2.1 丹參乙酸鎂對缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能評分、死亡率和腦梗死體積的影響 圖1A、B所示，sham組神經(jīng)功能評分均為0分，且實驗過程中無動物死亡，I/R組大鼠在缺血/再灌注后，出現(xiàn)較嚴重的神經(jīng)損傷(P<0.05)，且有33%的動物死亡；在丹參乙酸鎂干預(yù)下，與I/R組比較神經(jīng)損傷明顯減輕(P<0.05)，死亡率也從33%下降到了11%(χ2=9.084,P=0.028 2)。圖1C、D所示，將腦組織進行TTC染色后，非梗死區(qū)域呈紅色，梗死區(qū)域呈白色，與sham組比較I/R組大鼠有較大梗死區(qū)域(t=7.712，P=0.006)，丹參乙酸鎂干預(yù)下可以明顯縮小梗死體積(t=6.255，P=0.000 1)。

A圖為中位數(shù)，D圖為均數(shù)±標準差(n=8)；與sham組比較*P0.05，與sham組比較**P0.01，與I/R組比較+P0.05，與I/R組比較++P0.01圖1 丹參乙酸鎂對缺血/再灌注誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)功能評分、死亡率和腦梗死體積的影響

2.2 丹參乙酸鎂對缺血/再灌注大鼠腦組織中TGF-β1和ALK5水平的影響 如圖2所示，ELISA結(jié)果可見TGF-β1在腦缺血/再灌注模型中，含量較sham組有所增高(t=2.938，P=0.014 8)，而TGF-β1受體ALK5在缺血/再灌注過程中，mRNA水平(t=6.023，P=0.01)和蛋白水平(t=3.572，P=0.01)較sham組都顯著增高，TGF-β1/ALK5通路作用增強。給予丹參乙酸鎂干預(yù)后，與I/R組比較TGF-β1含量下降(t=2.515，P=0.023 6)，但是ALK5的轉(zhuǎn)錄(t=0.125 3，P=0.902 8)和翻譯(t=0.052 91，P=0.958 8)并沒有變化。

2.3 丹參乙酸鎂對缺血/再灌注大鼠腦組織中pSMAD2/3水平的影響 當(dāng)TGF-β1與其受體ALK5結(jié)合后，下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白SMAD2/3發(fā)生磷酸化，激活態(tài)的pSMAD2/3進入細胞核從而影響NOX的表達。如圖3所示，與sham組比較，I/R組TGF-β1和ALK5水平增高后，pSMAD2(t=5.313，P=0.000 3)和pSMAD3(t=9.649，P=0.001)的蛋白含量明顯升高，丹參乙酸鎂可以有效降低缺血/再灌注模型中pSMAD2(t=3.471，P=0.006)和pSMAD3(t=8.061，P=0.001)的激活。

數(shù)據(jù)為均數(shù)標準差(n=8),與sham組比較*P0.05，與sham組比較**P0.01，與I/R組比較+P0.05，與I/R組比較++P0.01圖2 丹參乙酸鎂對缺血/再灌注大鼠腦組織中TGF-β1和ALK5水平的影響

2.4 丹參乙酸鎂對缺血/再灌注大鼠腦組織中NOX活性、H2O2水平的影響 如圖4所示，與sham組相比，I/R組pSMAD2/3水平升高，引起下游NOX表達增多，酶活性增高(t=5.04，P=0.005)，H2O2水平提升(t=5.217，P=0.004)。丹參乙酸鎂給藥組可以減少腦缺血/再灌注引起的NOX活性(t=5.677，P=0.000 2)和H2O2水平變化(t=4.445，P=0.001 2)。

數(shù)據(jù)為均數(shù)標準差(n=8),與sham組比較**P0.01，與I/R組比較++P0.01圖4 丹參乙酸鎂對缺血/再灌注大鼠腦組織中NOX活性、H2O2水平的影響

3 討論

缺血性腦卒中是心腦血管系統(tǒng)的常見疾病，通常是由腦血管畸形、狹窄或血栓堵塞血管而引起，在治療窗內(nèi)給予擴血管藥或抗血栓藥恢復(fù)供血后，部分患者出現(xiàn)更為嚴重的神經(jīng)損傷情況，稱為缺血/再灌注損傷。氧化應(yīng)激是腦缺血/再灌注發(fā)生發(fā)展過程中一個很重要的機制，因為缺血引起氧和能量供應(yīng)不足使線粒體功能紊亂，細胞內(nèi)氧自由基生成增加和/或自由基清除能力不足，氧自由基在細胞內(nèi)積聚，誘導(dǎo)細胞凋亡和壞死。對此，臨床上會用自由基清除劑如依達拉奉等藥物保護神經(jīng)[9-10]。依達拉奉已在歐洲部分國家和日本上市，但其較嚴重的肝腎毒性限制了使用，因此尋找一個合適的抗氧化劑是十分必要的[11-12]。

丹參是我國中醫(yī)中傳統(tǒng)的活血化瘀藥物，研究發(fā)現(xiàn)丹參的水溶性提取物丹參多酚酸鹽和其主要成分丹參乙酸鎂能夠抑制血小板激活，并有廣泛的抗炎、抗氧化應(yīng)激的作用，可以在預(yù)后治療階段預(yù)防血栓的再次形成，又可以減少缺血/再灌注損傷，是理想的治療缺血性腦卒中的潛在藥物。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)丹參乙酸鎂能夠通過抑制NOX生成，減少H2O2水平，有效保護腦缺血/再灌注模型大鼠的神經(jīng)損傷、減小梗死區(qū)域、降低死亡率[4-5]，本研究同樣證明了該保護作用，但是其上游調(diào)控機制并不十分清楚。

在腦缺血/再灌注模型中可以看到，I/R組大鼠經(jīng)過缺血2 h、再灌注24 h后死亡率較高，存活大鼠的神經(jīng)損傷嚴重，進行TTC染色后可見梗死體積較大，能夠模擬臨床缺血性腦卒中發(fā)病情況。在給予丹參乙酸鎂干預(yù)后死亡率降低、神經(jīng)損傷減輕、梗死體積明顯減小，證明了丹參乙酸鎂具有良好的抗缺血/再灌注損傷的作用，而該作用是通過什么機制實現(xiàn)的？作者發(fā)現(xiàn)I/R組的TGF-β1和其受體ALK5的水平都有所升高，TGF/ALK5通路核轉(zhuǎn)錄效應(yīng)增強，使得SMAD2、SMAD3蛋白出現(xiàn)磷酸化，pSMAD2、pSMAD3水平顯著提高，而磷酸化的pSMAD2、pSMAD3又使得NOX的表達增加，氧化活性增強，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起細胞凋亡、壞死。給予丹參乙酸鎂干預(yù)后發(fā)現(xiàn)ALK5的表達依然較sham組有所升高，但TGF-β1的水平有所下降，I/R+MLB組減少TGF-β1生成后使得SMAD2/3磷酸化顯著減少，其下游的NOX活性與H2O2水平均較I/R組有所下降。

綜上所述，丹參乙酸鎂可以通過減少TGF-β1的水平抑制TGF-β1/ALK5/SMAD2/3/NOX/H2O2通路，在腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的保護作用。