賈建民，段 堃，李 巖，趙 艷，夏 偉，吳 凡，葛永超

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的生存健康，目前關(guān)于其發(fā)病機(jī)制仍不清楚[1-2]。由于在臨床中缺乏膀胱癌篩查及早期診斷的分子標(biāo)志物，很多患者被確診時(shí)已進(jìn)展為中晚期[3]。尋找膀胱癌有效的早期篩查及診斷分子標(biāo)志物，仍需要依靠基礎(chǔ)研究的進(jìn)展。PDZ連接激酶/T-LAK細(xì)胞源蛋白激酶(PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase，PBK/TOPK)為一種絲-蘇氨酸激酶，屬絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase，MAPKK)分子家族成員，目前研究表明其表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)[4-6]。在膀胱癌組織中發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK呈高表達(dá)[7]，PBK/TOPK表達(dá)是否影響膀胱癌BIU-87細(xì)胞的增殖及遷移能力，目前尚不清楚。本研究旨在進(jìn)一步探討膀胱癌中PBK/TOPK的表達(dá)，及其表達(dá)對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月—2016年12月鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院膀胱癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，共40例，所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診，其中男性30例，女性10例，年齡55～65歲，平均年齡62歲。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及生物免疫治療。癌旁組織為癌旁>3 cm的膀胱組織，所有新鮮標(biāo)本均置于液氮中保存。

1.2 主要儀器與試劑 RNAiso PLUS(日本TaKaRa公司)，氯仿(南京化學(xué)試劑股份有限公司)，異丙醇(南京化學(xué)試劑股份有限公司)，紫外分光光度計(jì)(美國(guó)ABI公司，型號(hào)：photoLab 6100)，逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，7500 PCR儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)：ABI7500)，PBK/TOPK多克隆抗體(美國(guó)Abcom 公司)，單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(美國(guó)ABI公司)，膀胱癌BIU-87細(xì)胞株(上海銳聰實(shí)驗(yàn)中心)，胎牛血清(南美hyclone公司)，DMEM(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)必需培養(yǎng)基(上海中喬新舟生物科技公司)，CO2孵箱(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：BPX-250-Z/BPX-250-ZS/BPX-150-Z)，CCK-8(Cell Counting Kit 8)溶液(北京沃比森科技有限公司)，酶標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司，型號(hào)：DG5035A)，Transwell小室(北京明陽(yáng)科華生物技術(shù)有限公司)，姬姆薩染色液(廈門海標(biāo)科技有限公司)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR(quantificational real time-PCR，qRT-PCR) 收集新鮮的膀胱癌及癌旁正常膀胱組織標(biāo)本，加入液氮，研磨成粉末加入1 mL RNAiso PLUS充分裂解細(xì)胞，室溫靜置5 min。按照0.2 mL氯仿/1 mL RNAiso PLUS的比例加入氯仿，漩渦振蕩器上劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃、12 000 rpm離心20 min，取上清液再加入等體積的異丙醇沉淀RNA，室溫靜置10 min后，4 ℃、12 000 rpm離心10 min，棄去上清，用焦碳酸二乙酯水溶解沉淀，于紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280，計(jì)算RNA的濃度，取A260/A280值為1.8～2.0進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采用逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR試劑盒，嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行，其中逆轉(zhuǎn)10 μL體系包括2 μL的5×PrimeScriptTMRT Master Mix、500 ng的RNA，加RNase-freed H2O至10 μL，逆轉(zhuǎn)條件為37 ℃15 min，85 ℃滅活15 s。上樣量為20μL體系[包括SYBR PremixEx TaqTMⅡ(2×)10 μL，上游引物及下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL]，于7500 PCR儀定量檢測(cè)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性34 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，其中，PBK/TOPK上游引物序列為：5′-GAGAGTGGCTTTCACAATGGA-3′，下游引物序列為：5′-GGCCGGGATATTTATAGTTGGA-3′；內(nèi)參β-actin上游引物序列為：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物序列為：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAG AAGCA-3′，引物均由深圳華大基因有限公司設(shè)計(jì)合成。樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以2-△△ct計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，即：△Ct=(目的基因-內(nèi)參基因)，△△Ct=△Ct患者-△Ct對(duì)照，以2-△△Ct作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot) 收集新鮮標(biāo)本，加入液氮，研磨成粉末加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，采用蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。以50 μg蛋白上樣于聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠2 h，再將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，封閉后滴加PBK/TOPK多克隆抗體(稀釋比例1∶1 500)和單克隆GAPDH抗體(稀釋比例1∶2 000)，置于4 ℃冰箱孵育過夜。Tris緩沖鹽水洗滌后，滴加二抗孵育1 h，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)PBK/TOPK蛋白表達(dá)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 參見相關(guān)文獻(xiàn)[8]，將膀胱癌BIU-87細(xì)胞采用含15%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為干擾組、對(duì)照組及過表達(dá)組，干擾組轉(zhuǎn)染特異性siPBK/TOPK干擾片段，對(duì)照組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，過表達(dá)組轉(zhuǎn)染外源性PBK/TOPK質(zhì)粒。siPBK/TOPK干擾片段為：5′-CCCUGAGGCUUGUUACAUUdTdT-3′，PBK/TOPK干擾片段、過表達(dá)質(zhì)粒及無關(guān)序列均由上海吉?jiǎng)P生物有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.6 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/mL，取100 μL細(xì)胞懸液鋪板于96孔板，鋪板后12 h，加入CCK-8溶液培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀上測(cè)定細(xì)胞的光密度(optical density value，OD)值，波長(zhǎng)設(shè)為570 nm，每組設(shè)5個(gè)副孔，連續(xù)觀察5 d。

1.7 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，取500 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，同時(shí)加入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基于小室的下室，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后，取出小室，用棉簽擦去Transwell上室內(nèi)未穿過濾膜的細(xì)胞，經(jīng)95%酒精固定后行姬姆薩染色液染色，在高倍顯微鏡下(20×)隨機(jī)取10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)遷移出Transwell上室的細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 PBK/TOPK在膀胱癌組織中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明：膀胱癌組織中PBK/TOPK mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.324，P=0.000)；同時(shí)，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示PBK/TOPK蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)也明顯高于癌旁組織，圖1。

圖1 qRT-PCR及Western blot檢測(cè)PBK/TOPK在膀胱癌組織中的表達(dá)

2.2 膀胱癌BIU-87細(xì)胞中PBK/TOPK表達(dá)的干擾及過表達(dá) 經(jīng)轉(zhuǎn)染PBK/TOPK干擾片段后，PBK/TOPK mRNA在膀胱癌BIU-87細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-62.191，P=0.000，表1)。同時(shí)，經(jīng)轉(zhuǎn)染PBK/TOPK過表達(dá)質(zhì)粒后，PBK/TOPK mRNA在膀胱癌BIU-87細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.887，P=0.007，表2)；同時(shí)，Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明經(jīng)轉(zhuǎn)染后PBK/TOPK蛋白均被成功地敲低及過表達(dá)，圖2。

表1 qRT-PCR檢測(cè)干擾后膀胱癌BIU-87細(xì)胞中PBK/TOPK mRNA的表達(dá)水平

表2 qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)后膀胱癌BIU-87細(xì)胞中PBK/TOPK mRNA的表達(dá)水平

2.3 PBK/TOPK表達(dá)對(duì)BIU-87細(xì)胞增殖及遷移能力的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干擾PBK/TOPK表達(dá)能明顯抑制BIU-87細(xì)胞的增殖，而PBK/TOPK過表達(dá)能明顯促進(jìn)BIU-87細(xì)胞的增殖(圖3，P=0.000)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干擾PBK/TOPK表達(dá)能明顯抑制BIU-87細(xì)胞的遷移(t=20.212，P=0.000)，而PBK/TOPK過表達(dá)能明顯促進(jìn)BIU-87細(xì)胞的遷移(t=16.652，P=0.000)，圖4。

圖2 qRT-PCR及Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PBK/TOPK在膀胱癌BIU-87細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 PBK/TOPK表達(dá)與膀胱癌BIU-87細(xì)胞增殖的關(guān)系

A：PBK/TOPK干擾組細(xì)胞的遷移數(shù)(20×)；B：PBK/TOPK對(duì)照組細(xì)胞的遷移數(shù)(20×)；C：PBK/TOPK過表達(dá)組細(xì)胞的遷移數(shù)(20×)；D：細(xì)胞遷移數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析圖4 PBK/TOPK表達(dá)與膀胱癌BIU-87細(xì)胞遷移的關(guān)系

3 討論

PBK/TOPK是一種絲-蘇氨酸激酶，首先由Gaudet等[4]于2000年在Hela細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆出來，命名為PBK。隨后，Abe等[9]構(gòu)建T-LAK細(xì)胞cDNA文庫(kù)克隆出新型的蛋白激酶，命名為TOPK，然而通過序列分析發(fā)現(xiàn)TOPK與PBK為同一種分子，為此命名為PBK/TOPK。PBK/TOPK含有322個(gè)氨基酸，介導(dǎo)淋巴因子激活的殺傷T(T-LAK)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。由于PBK/TOPK缺少M(fèi)APKK家族中維持催化功能的重要結(jié)構(gòu)域，因此PBK/TOPK本身沒有催化活性，主要參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期中有絲分裂期的紡錘體形成，其異常表達(dá)具有強(qiáng)烈的細(xì)胞致癌潛能[5]。目前研究表明PBK/TOPK在多種惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌及白血病等[10-13]。此外，Singh等[7]檢測(cè)了PBK/TOPK在65例膀胱癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK陽(yáng)性表達(dá)率為64.6%，其在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的表達(dá)明顯高于非肌層浸潤(rùn)膀胱癌組織中的表達(dá)，提示PBK/TOPK表達(dá)可能有助于膀胱癌細(xì)胞的增殖及侵襲，然而仍缺乏可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此，探討PBK/TOPK在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能仍具有潛在的研究?jī)r(jià)值。

本研究結(jié)果顯示PBK/TOPK在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，與相關(guān)報(bào)道一致[7]，進(jìn)一步提示PBK/TOPK陽(yáng)性表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生有關(guān)，可能為膀胱癌的分子標(biāo)志物。此外，通過干擾及過表達(dá)PBK/TOPK在膀胱癌BIU-87細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)干擾PBK/TOPK表達(dá)明顯抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖及遷移，而PBK/TOPK過表達(dá)能明顯促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖及遷移。這些結(jié)果提示PBK/TOPK在膀胱癌中具有調(diào)控細(xì)胞增殖及遷移的能力，可能會(huì)影響膀胱癌患者的病情進(jìn)展。同時(shí)，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌及白血病中發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK表達(dá)也有助于腫瘤細(xì)胞的增殖[10,14-15]，與本研究結(jié)果較為一致，均提示PBK/TOPK表達(dá)有助于腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，PBK/TOPK表達(dá)與口腔癌及肺癌患者的預(yù)后相關(guān)[10,16]，然而，PBK/TOPK表達(dá)是否會(huì)影響膀胱癌患者的預(yù)后，目前仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。

目前，關(guān)于PBK/TOPK在膀胱癌中的作用機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK在乳腺癌中能通過激活p38及MAPK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖[17]。在肺癌中，TOPK/PBK能通過PI3K/PTEN/AKT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的遷移[18]。然而，PBK/TOPK促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖及遷移的機(jī)制是否與p38、MAPK及PI3K/PTEN/AKT信號(hào)通路有關(guān)仍不清楚，有待于進(jìn)一步的深入研究。