馮雨嘉，蔣佳志，晏 鑫，郭梓鑫，李 勝，孟詳喻，陳 松

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長趨勢[1]。盡管治療手段多樣且不斷改進(jìn)，但復(fù)發(fā)率仍較高，尤其肌層膀胱癌和轉(zhuǎn)移性膀胱癌的預(yù)后更差，近十年治療未取得重要進(jìn)展[2]。

驅(qū)動蛋白家族成員2C(kinesin family member 2C，KIF2C)，也叫分裂著絲粒相關(guān)驅(qū)動蛋白(mitotic centromere associated kinesin,MCAK)，是驅(qū)動蛋白家族-13中最具代表性的成員，參與微管的解聚、二極紡錘體的形成和染色體的分離，從而對有絲分裂和細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)。KIF2C可以使細(xì)胞間期中微管的穩(wěn)定性降低，抑制KIF2C可以導(dǎo)致多種動點-微管附著缺陷，動點-微管的連接異?？梢詫?dǎo)致非整倍染色體細(xì)胞的產(chǎn)生。此外，KIF2C表達(dá)水平的降低或缺失將導(dǎo)致有絲分裂S期染色體的排列異常和G2期染色體的錯誤分離，從而破壞正常的有絲分裂進(jìn)程，這些都被認(rèn)為是誘發(fā)腫瘤的潛在原因[3]。但是，KIF2C基因在膀胱癌中的表達(dá)研究報道較少。

本研究通過收集美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫的公共數(shù)據(jù)集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，分析KIF2C在膀胱癌中的表達(dá)情況，探究KIF2C與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系，并使用基因集富集分析(gene sets enrichment analysis,GSEA)的方法預(yù)測在膀胱癌細(xì)胞中可能受KIF2C調(diào)控的基因集，為進(jìn)一步研究KIF2C在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供線索和思路。

1 資料和方法

1.1 資料 從GEO數(shù)據(jù)庫中下載基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，選取標(biāo)準(zhǔn)為包含KIF2C表達(dá)數(shù)據(jù)的人類膀胱癌和正常膀胱組織的表達(dá)譜。數(shù)據(jù)集GSE13507[4]使用Illumina公司的Illumina human-6 v2.0 expression beadchip基因表達(dá)芯片，該數(shù)據(jù)集包含了165例原發(fā)性膀胱癌和10例正常膀胱組織的基因表達(dá)譜及性別、年齡、TNM分期等臨床信息。在GSE13507數(shù)據(jù)集中篩選了膀胱癌患者和正常膀胱組織的KIF2C基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息。使用GSE13507數(shù)據(jù)集用于GSEA分析。在數(shù)據(jù)集GSE13507中，KIF2C基因?qū)?yīng)的探針為ILMN_1685916。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)分組 對樣本數(shù)據(jù)集GSE13507做回顧性研究和生存期分析，排除其中臨床資料缺失的樣本，根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)對樣本的KIF2C的表達(dá)進(jìn)行由高到低排序后，取前50%的樣本為高表達(dá)組(n=82)，后50%的樣本為低表達(dá)組(n=83)。

1.2.2 挖掘樣本富集基因 采用GSEA3.0版本[5]進(jìn)行分析。GSE13507被納入GSEA。膀胱癌組織樣本根據(jù)KIF2C的表達(dá)水平被分為高表達(dá)組和低表達(dá)組后，通過GSEA分析KIF2C的表達(dá)水平對各種生物通路基因集的影響。GSEA網(wǎng)站的MsigDB數(shù)據(jù)庫中獲得的基因集作為參照基因集，按照默認(rèn)加權(quán)富集統(tǒng)計(GSEA說明詳見http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)的方法，每次隨機重復(fù)1 000次進(jìn)行分析。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理及作圖 統(tǒng)計學(xué)處理以及作圖分別使用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5軟件。使用兩獨立樣本t檢驗的方法進(jìn)行膀胱癌細(xì)胞與正常膀胱組織細(xì)胞中基因表達(dá)差異的比較。臨床病理相關(guān)性分析中，組間比較采用聯(lián)列表法和χ2檢驗。進(jìn)行生存分析時，使用Log-rank(Mantel-Cox)法比較KIF2C高表達(dá)與低表達(dá)組的生存期，以P<0.05為差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義。在GSEA中，P<0.05及錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates,FDR)<0.25的基因集作為顯著富集基因集。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織和正常膀胱組織中KIF2C的表達(dá) 在膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中，KIF2C在正常膀胱組織中低表達(dá)(7.390±0.043，n=10)，在膀胱癌組織中高表達(dá)(8.959±0.086，n=165)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.000 1，圖1)。

圖1 膀胱癌組織和正常膀胱組織中KIF2C的表達(dá)

2.2 KIF2C表達(dá)水平與膀胱癌的臨床病理相關(guān)性 在膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中，疾病是否進(jìn)展(P=0.009)、疾病分級(P=0.000)、T分期(P=0.000)、N分期(P=0.013)與KIF2C的表達(dá)差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義；M分期與KIF2C的表達(dá)差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.687，表1)。

2.3 KIF2C與膀胱癌患者的預(yù)后相關(guān)性 在膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中，KIF2C高表達(dá)組和低表達(dá)組的5年腫瘤特異性生存率分別為67.986%和92.203%(Log-rank=13.030，P=0.0003，HR=0.2743，95%CI：0.1359～0.5537，圖2A)；5年總生存率分別為50.969%和70.538%(Log-rank=9.217，P=0.0024，HR=0.4700，95%CI：0.2887～0.7652，圖2B)。

2.4 KIF2C高表達(dá)的基因集富集 用GSEA方法分析KIF2C的表達(dá)水平對各種生物通路基因集的影響，使用基因集“oncogenic gene sets”作為參照基因集，GSEA的結(jié)果顯示KIF2C高表達(dá)的樣本富集了與核糖體蛋白質(zhì)、多梳蛋白、內(nèi)源性核糖核酸酶、E2F轉(zhuǎn)錄因子、抑癌基因RB有關(guān)的基因集(表2)。

表1 KIF2C表達(dá)水平與膀胱癌的臨床病理相關(guān)性

注：N分期KIF2C高表達(dá)組有1例數(shù)據(jù)刪失

圖2 膀胱癌患者生存曲線

基因集富集分?jǐn)?shù)FDRP值RPS14dn.v1dn-0.75120.0128<0.0001PRC2EZH2up.v1up-0.70420.0092<0.0001E2F1up.v1up-0.70140.0089<0.0001E2F3up.v1up-0.69210.0114<0.0001CSRlateup.v1up-0.73270.0108<0.0001Rbp130dn.v1up-0.64000.01130.0020GCNPSHHupearly.v1up-0.68550.02460.0021

3 討論

驅(qū)動蛋白包括一個巨大的馬達(dá)蛋白超家族，它最初是1985年在魷魚神經(jīng)細(xì)胞大軸突內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的，主要存在于真核細(xì)胞內(nèi)。驅(qū)動蛋白在有絲分裂中起著重要作用，這啟發(fā)人們思考通過抑制驅(qū)動蛋白的生物學(xué)功能來抑制腫瘤的生長，以此作為治療癌癥的手段。通過破壞驅(qū)動蛋白的軌道—微管蛋白[6]，可以有效的對癌癥進(jìn)行控制和治療。目前微管蛋白抑制劑(microtubule inhibitor,MTI)已經(jīng)可以成功地抑制有絲分裂，達(dá)到阻礙癌細(xì)胞增殖的效果。

KIF2C/MCAK(染色體1p34)是驅(qū)動蛋白家族中最具特征的成員[7]，以往的研究表明KIF2C對紡錘體組裝和確保有絲分裂過程中染色體的分離起著重要作用[8-10]，KIF2C的過表達(dá)可以抑制染色體不穩(wěn)定的細(xì)胞系中細(xì)胞染色體的分離錯誤[11]。在有絲分裂過程中，KIF2C還在維持遺傳完整性方面起著重要的作用。有研究表明KIF2C基因的表達(dá)水平與增殖細(xì)胞核抗原(Ki-67)密切相關(guān)[12]，Ki-67是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)，是目前多種惡性腫瘤研究中的熱門生物指標(biāo)，可以通過Ki-67抗原的檢測了解惡性腫瘤的細(xì)胞增殖活性。多項惡性腫瘤研究表明，KIF2C過表達(dá)可能與乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤的進(jìn)展有關(guān)[13-16]，這可能與非整倍體的形成有關(guān)[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)KIF2C在膀胱癌組織中較正常膀胱組織表達(dá)上調(diào)，提示KIF2C的表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。類似的結(jié)果在結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、頭頸癌和乳腺癌中也有發(fā)現(xiàn)。Gnjatic等[16]研究顯示，KIF2C在結(jié)腸癌細(xì)胞系和結(jié)直腸癌患者的惡性組織中表達(dá)上調(diào)，在胃癌、胰腺癌、頭頸癌和乳腺癌中均有表達(dá)上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)KIF2C可能是多種癌癥主動免疫治療的靶點之一。Duan等[18]研究表明，腫瘤組織中的KIF2C表達(dá)有望作為男性食管鱗狀上皮細(xì)胞癌患者的獨立預(yù)后標(biāo)志。Shimo等[14]研究表明，KIF2C在乳腺癌組織中高表達(dá)，并且可能在乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞分裂中扮演重要的角色，此研究還通過cDNA微陣列數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了在胰腺癌和膀胱癌中，KIF2C/MCAK都有表達(dá)上調(diào)，提示KIF2C高表達(dá)組膀胱癌患者的臨床病理特征(如疾病進(jìn)展，腫瘤分級，T分期，N分期)明顯差于KIF2C低表達(dá)組的患者，說明KIF2C的高表達(dá)與膀胱癌的惡性程度及疾病進(jìn)展密切相關(guān)。GESA分析揭示其機制可能是，高表達(dá)KIF2C通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期(內(nèi)源性核糖核酸酶、E2F轉(zhuǎn)錄因子)、細(xì)胞增殖(多梳蛋白、抑癌基因RB)和細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(核糖體蛋白質(zhì))相關(guān)的基因集，影響膀胱癌細(xì)胞的增殖和代謝進(jìn)而推動膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究生存期分析提示KIF2C高表達(dá)的患者術(shù)后生存期更短、復(fù)發(fā)更快，KIF2C有望成為評估膀胱癌預(yù)后的標(biāo)志物之一。本研究的局限性和啟示：①由于數(shù)據(jù)集樣本量的限制，未來實驗研究需擴大樣本量、嚴(yán)格分組來進(jìn)一步驗證；②KIF2C調(diào)控這些信號通路的作用機制還不十分清楚，是否為膀胱癌患者臨床預(yù)后的獨立危險因素，還有待更深入的機制研究加以驗證。

綜上所述，KIF2C可通過多種途徑來促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和分裂，進(jìn)而影響膀胱癌患者的臨床預(yù)后。因此，KIF2C有希望成為診斷膀胱癌的標(biāo)志物或潛在治療靶點，這為未來的臨床研究提供了新的思路。