方建雄 劉久敏 蒲小勇

現(xiàn)階段前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性最常見的惡性腫瘤之一，在歐美男性中其發(fā)病率排名第一，死亡率排名第二[1]。我國PCa的發(fā)病率及死亡率均較世界平均水平低[2]，這一方面與人種因素及生活條件等有關，另一方面可能是因為西方國家PCa的篩查機制、體檢制度較完善，容易發(fā)現(xiàn)更多早期PCa患者[1]。由于我國人口基數(shù)大，且近年來人口老齡化問題嚴重，我國PCa的發(fā)病率較之前明顯上升。2016年中國腫瘤登記中心收集的數(shù)據(jù)顯示，2013年我國PCa新發(fā)病例約6萬例，在男性惡性腫瘤發(fā)病率中排名第六位，在城市男性惡性腫瘤中排名也是位居第六，與2012年腫瘤登記數(shù)據(jù)相比上升明顯[3]。這表明，隨著我國老齡人口的增多，PCa已經(jīng)成為嚴重影響我國男性健康的泌尿系惡性腫瘤。

雖然已經(jīng)研究開發(fā)出了許多已證實具有生存獲益的新型療法，但其對PCa患者生存率的提高仍微不足道。臨床上PSA常用作PCa檢測的生物標記，被廣泛用于治療選擇、療效觀察和臨床隨訪的決策中。而Gleason組織病理學評分被用作PCa的重要預后指標。盡管PSA及Gleason評分應用廣泛，但其作為一種篩查和預后評估工具，表現(xiàn)并不理想，因缺乏特異性，PSA并不能可靠地區(qū)分癌癥與良性前列腺疾病，其在預測疾病和治療方面準確性欠佳。因此需要開發(fā)新的生物標記來滿足這些臨床需求。近年來許多研究都指出外泌體是PCa的一種潛在的腫瘤標志物，外泌體未來作為PCa的預后因素的前景也被看好。本文對以外泌體作為PCa腫瘤標志物的相關研究成果以及研究前景進行了分析和總結，綜述如下。

一、前列腺外泌體簡介

1.外泌體的起源、組成和保存：1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，1987年Johnstone將其命名為“exosome”。人體大多數(shù)類型細胞都能分泌外泌體，它是一種小(30～150 nm)雙脂膜囊泡，包含具有特異性質的蛋白質、脂質和核酸[4]。蛋白質為外泌體內(nèi)容物的主要成分，參與外泌體的結構形成、膜轉運及融合、抗原呈遞及腫瘤發(fā)生和發(fā)展等過程。外泌體能攜帶大量核酸，其脂質雙分子層結構可避免核酸被降解，并將核酸轉運到特定靶細胞發(fā)揮重要的調(diào)控作用。目前，關于外泌體內(nèi)攜帶的核酸，相關研究[4]發(fā)現(xiàn)兩種已知的PCa核酸生物標記，PCa抗原3(PCA3)和TMPRSS2-ERG融合基因，可以在從PCa患者尿液中分離出來的外泌體中檢測出來。且越來越多的證據(jù)表明，在體液中循環(huán)的微小RNA(microRNA,miRNA)也存在于外泌體中[5]。此外，不同的親代細胞產(chǎn)生的外泌體其內(nèi)容物有顯著差異，親代細胞所處的不同的生理狀態(tài)對于外泌體內(nèi)容物的生化性質也有顯著的影響[6]。由前列腺組織分泌的外泌體也有類似的特點，其分布十分廣泛，目前可以通過非侵入性手段在血液、尿液以及精液中檢測到，且其在體液中非常穩(wěn)定，所以外泌體被認為是目前PCa腫瘤標志物研究中很有前景的一個方向。

2.外泌體的分離與提?。宏P于外泌體的分離與提純，目前還沒有一種方法可以經(jīng)濟有效地獲取高度純凈且具有良好特征的外泌體。傳統(tǒng)的外泌體提取方法主要包括：①超速離心法[7-8]，這是目前外泌體提取最常用的方法。這種方法是由多個離心步驟組成，通過提高速度連續(xù)離心來消除大量死細胞和大細胞碎片，使用時將沉淀物丟棄，并將上清液用于以上步驟，以順序分離出沉淀細胞(300 g)及微泡(10 000 g)等，然后將最終的上清液以100 000×g超速離心以沉淀與外泌體相對應的小囊泡。最后以大量磷酸緩沖鹽溶液洗滌沉淀物，除去污染的蛋白質，并以相同的速度離心最后一次。此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足，不能很好地區(qū)分提純微泡及外泌體。②過濾離心法[4]，這種方法操作簡單、省時，不影響外泌體的生物活性，但提取到的外泌體純度甚至不如超速離心法，現(xiàn)在已少用。③密度梯度離心法[9]，基于密度梯度的隔離,使用蔗糖或碘克沙醇，用這種方法可以提取到高純度的外泌體，但是制備工序繁雜，耗時，一般用于實驗室對外泌體的提存研究，目前難以應用于臨床檢測。

針對以上問題，新的外泌體檢測技術被不斷地開發(fā)并應用于臨床和實驗室檢測。如免疫磁珠法[10]，或者以此為基礎的PS(磷脂酰絲氨酸)親和法[11]，即使用Tim4蛋白以特異性地結合細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)表面上顯示的磷脂酰絲氨酸。因為這種結合是Ca2+依賴性的，通過添加Ca2+螯合劑可以很容易地從Tim4釋放完整的EVs。研究發(fā)現(xiàn)，這種方法獲得的外泌體形態(tài)完整，純度最高，不會影響外泌體的生物活性；相比傳統(tǒng)方法，使用Tim4蛋白純化能夠獲得更高純度的EVs。制備高純度的EVs對于后續(xù)的質譜法檢測EVs特異性蛋白質有重要的意義，有利于更好地表征和定量不同的EVs群體的蛋白質組。此外，也有一些用于外泌體分離提存的商業(yè)試劑盒，包括沉淀溶液[12]，例如ExoQuick或Total Exosome Isolation試劑盒[7,13-14]，以及柱基的測定，例如exoRNeasy血清/等離子體。

3.外泌體的作用與作用機制：外泌體在1980年剛被發(fā)現(xiàn)時，被認為其作用單一，主要參與細胞排泄廢物的過程。如今大量關于外泌體生物來源、信號傳導通路甚至其在體液中的分布差異等研究相繼開展，發(fā)現(xiàn)外泌體具多方面的功能。它在生理進展過程中的具體功能主要取決于其所來源的細胞類型，不同細胞產(chǎn)生的外泌體由不同的成分組成，攜帶了不同的生物信息。如腫瘤細胞產(chǎn)生的外泌體在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，它甚至直接促進腫瘤的侵襲、轉移、耐藥和免疫逃逸。有研究表明腫瘤來源的外泌體參與腫瘤細胞與基底細胞遺傳信息的交換，改變腫瘤生長的微環(huán)境，從而導致大量新生血管的生成，為促進腫瘤的生長與侵襲創(chuàng)造了有利的條件[6,15-16]。Hashimoto等[17]對幾種人類癌細胞系分泌的外泌體miRNA進行了全面的表達分析，并鑒定了其中8種類型的人類miRNA，這些來源于腫瘤細胞外泌體的miRNA在成骨細胞表型誘導PCa細胞系的外泌體中高表達。其中的一種miRNA，即hsa-miR-940，通過靶向ARHGAP1和FAM134A，在體外可以顯著促進人間充質干細胞的成骨分化。研究表明，從癌細胞衍生的外泌體是細胞間的動態(tài)的微型工廠，它積極地促進疾病特別是腫瘤的進展[18]。

關于外泌體的作用機制，目前主要有兩種觀點：①外泌體膜蛋白或經(jīng)過修飾的外泌體外膜蛋白可以與靶細胞膜蛋白結合，進而激活靶細胞細胞內(nèi)的信號通路。如Webber等[6]的研究認為，人體內(nèi)TGFb1蛋白的某些片段與癌細胞分泌的細胞外納米囊泡即外泌體相關，并且提出了可溶的囊泡TGFb1在基質激活過程中的重要性，而肌成纖維細胞富集基質的激活是癌癥進展必不可少的限速步驟。更有趣的是，該研究使用非外泌體形式下的可溶性TGFb1則不能促進腫瘤血管生成或腫瘤組織的增大，這進一步說明了外泌體在腫瘤發(fā)展進程中起不可或缺的作用。在類似的問題上，F(xiàn)ranzen等[8]研究發(fā)現(xiàn),將尿道上皮細胞暴露于肌層浸潤性膀胱癌產(chǎn)生的外泌體的環(huán)境后，上皮型標志物的表達顯著降低，而間質型的表達顯著升高，即外泌體在尿路上皮細胞發(fā)生上皮-間質型轉化過程中起重要作用。Hosseini-Beheshti等[9]探討外泌體在旁分泌信號通路中的作用時也得出了類似的結論，他們從PCa細胞中提取出外泌體，發(fā)現(xiàn)PCa相關的外泌體可以促進癌癥的進展，減少細胞凋亡，增加癌細胞增殖，并誘導細胞在LNCaP和rwpe1細胞中遷移，同時還表明，當小鼠靜脈內(nèi)施用DU145細胞來源的外泌體時，可以增加體內(nèi)腫瘤體積和血清PSA水平。②外泌體膜可以與靶細胞膜直接融合，非選擇性地釋放其所含的蛋白質、mRNA以及miRNA。Singh等[15]研究發(fā)現(xiàn)，avb3 整聯(lián)蛋白通過外泌體從致瘤細胞轉移到非致瘤性細胞，在靶細胞重新表達的avb3 整聯(lián)蛋白可以介導靶細胞的遷移和黏附，從而加快局限性PCa向轉移性PCa方向發(fā)展。相似的研究結果在外泌體相關的avb6 整聯(lián)蛋白的研究中也得到了印證[19]。同時，Al Saleh等[20]的研究也證實，PCa細胞脫落的EVs可能參與促凝分子組織因子和纖溶酶原激活物抑制劑-1的調(diào)節(jié)，這與腫瘤細胞的致癌性和轉移特性有關。

二、外泌體與PCa

1.外泌體與PCa的診斷：為了解決臨床篩查中PSA特異度低的問題，研究者一直在尋找敏感度和特異度均佳的腫瘤標志物，以減少目前臨床上無謂的前列腺穿刺活檢術。而在這一方面，外泌體顯示出很好的臨床前景。一方面，外泌體來源廣泛，人類細胞分泌的外泌體遍布在血液、尿液以及各種體液(如唾液、腹水、精液等)中，這些檢測標本可以采用無創(chuàng)的方法獲取，減輕患者痛苦，這是其作為腫瘤標志物的一大優(yōu)勢；另一方面，外泌體獨特的雙脂膜囊泡結構可以最大程度避免囊內(nèi)相應的腫瘤相關蛋白、核酸等被外界酶分解。Hendriks等[21]比較了全尿、尿沉渣及外泌體中PCA3和TMPRSS2-ERG的表達，認為外泌體是一種強大的生物標志物來源，但測得的生物標志物水平在全尿中最高，而外泌體次之。針對PCa來說，外泌體的一個獨特優(yōu)勢在于，前列腺液中的外泌體也是PCa患者外泌體獲取的一個重要標本來源。按摩前列腺后再收集尿液和前列腺液的混合物，所得的前列腺液直接來源于前列腺且富含外泌體，對PCa的早期診斷具有獨特價值。Duijvesz等[22]應用高靈敏度時間分辨熒光免疫測定法比較分析了PCa患者和對照組患者尿液中外泌體的表達差異，結果發(fā)現(xiàn)PCa患者外泌體膜囊中CD63+和CD9+的表達顯著高于對照組，且按摩前列腺后收集到的尿液與前列腺液的混合物其CD63+和CD9+的表達相比普通空白對照組患者顯著增高(P=0.000 6)。目前關于外泌體在PCa診斷中的研究不是很多，基于蛋白組學技術，?verbye等[23]應用質譜法分析了15例健康人和16例PCa患者尿液中外泌體的蛋白質組，以鑒定蛋白質。研究顯示，PCa患者尿液中的外泌體，其中246種蛋白質發(fā)生了明顯的改變。作者發(fā)現(xiàn)，17種蛋白質的靈敏度超過60%，特異度為100%。敏感的是跨膜蛋白256(TM256)(94%)、LAMTOR1(81%)和ADIRF(81%)。此外，TM256和LAMTOR1可用于提高檢測的靈敏度，報道中TM256的曲線下面積為0.87，與LAMTOR1合并后可增加到0.94。相較于外泌體蛋白質的分析，目前的研究主要還是集中在外泌體的核酸上，如miRNA-1290、miRNA-375、PTEN、TMPRSS2-ERG和PCA3等，其在PCa患者的外泌體中表達均升高[24]。Bhagirath等[25]研究發(fā)現(xiàn)外泌體源性的miRNA在侵襲性PCa患者中表達失調(diào)。他們分別從侵襲性PCa組(n=6)，年齡和種族匹配的正常病例組(n=3)和良性前列腺增生組(n=3)3組患者血液中提取外泌體miRNA，進行鑒定。結果顯示相對于正常組及良性前列腺增生組，miR-1246、miR-766-3p和miR-302c-3p三者在侵襲性PCa中均表達失調(diào)。其中外泌體相關的miRNA (ex-miR-1246)可以用于區(qū)分正常、良性前列腺增生和侵襲性PCa。與正常組相比，ex-miR-1246在侵襲性PCa中上調(diào)>31倍(P=0.026)。與良性前列腺增生相比，ex-miR-1246在侵襲性PCa中上調(diào)>23倍(P=0.035)。這表明ex-miR-1246是區(qū)分侵襲性PCa和良性前列腺增生的潛在標志物。需要注意的是，外泌體本身作為PCa腫瘤標志物并不具有疾病特異性或者器官特異性，但是外泌體包含的豐富的蛋白質、核酸和脂質等可能具有器官或者疾病特異性，這需要進一步的研究來證實。

2.外泌體與PCa的預后：目前，臨床上Gleason評分的高低與PCa生物學行為和預后有較好關聯(lián)[2]。此外，國際泌尿病學學會和2016年世界衛(wèi)生組織藍皮書在原來Gleason評分的基礎上提出使用五種危險分層的PCa分級系統(tǒng)，即預后分組(prognostic grade groupings，PGGs)系統(tǒng)。它的5個預后級別(PGGs)按照從1級到5級分別定義為Gleason評分≤6、3+4、4+3、8和>8，且隨著級別的增加，觀察到基因組發(fā)生擴增和缺失(P=0.013)和非同義點突變(P=0.008)的頻率顯著增加[26]。而從外泌體的作用機制可見外泌體在腫瘤進展、侵襲和轉移過程中扮演了重要的角色，因此許多學者猜測外泌體與腫瘤預后相關。目前臨床上使用的Gleason評分在這一方面較為準確，但是相對而言，外泌體無疑是個更方便快捷的預測手段，目前對此的研究較少，具體的臨床應用價值需要進一步深入研究。研究表明，PCa的微泡(50～150 nm)或前列腺相關的外泌體在PCa患者中的表達水平更高，且與Gleason評分相關，Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PCa患者血液中的外泌體循環(huán)長鏈非編碼RNA正在成為對腫瘤診斷有價值和非侵入性生物標志物，其中SAP30L-AS1的表達水平與PSA值和腫瘤侵襲有關，另外 Gleason評分較高的患者SChLAP1表達也顯著升高。Li等[14]研究認為，在PCa患者中，血清外泌體miR-141的水平明顯高于前列腺增生患者和健康對照組，且其中轉移性PCa患者水平最高。與前列腺增生患者或是健康志愿者相比，PCa患者血清外泌體中的miR-141上調(diào)，其中在轉移性PCa患者中，miRNA-141達到最高水平，而受試者操作特征曲線顯示，血清外泌體的 miR-141在局限性PCa患者中鑒別出轉移性PCa患者的靈敏度為80%，特異度為87.1%，曲線下面積為0.869 4，這提示其可能是診斷轉移性PCa的一種有用的潛在生物標志物。Stone[5]聯(lián)合外泌體基因表達測定以及SOC測試(包括PSA水平、年齡、種族和家族史)，發(fā)現(xiàn)它們在預測Gleason評分≥7和陰性活檢結果方面比單獨SOC測試更好，且針對高級別PCa，當臨界值為15.6時，靈敏度為92%，活檢抽樣回避率為27%，而只有大約8%的Gleason評分≥7的癌癥會被遺漏。類似的研究中，Bhagirath等[25]發(fā)現(xiàn)PCa陽性淋巴結轉移與血源性外泌體提取到的標志物ex-miR-1246的高表達之間存在相關性(P=0.043 6)，這也進一步說明該miRNA具有預測PCa侵襲性或者局部轉移的潛力。此外高表達的ex-miR-1246與病理分期之間存在顯著的負相關(P=0.002 0)，表明該外泌體標志物會隨著PCa分期的增加而增加。另外一項關于PCa合并骨轉移的研究發(fā)現(xiàn)，PCa細胞外泌體中高表達的hsa-miR-940在體外可以促進人間充質干細胞的成骨分化，并在體內(nèi)骨轉移微環(huán)境中誘導廣泛的成骨細胞損傷，這說明外泌體在PCa骨轉移方面具有預測價值[17]。

三、總結與展望

外泌體的組成復雜多樣，廣泛分布于人體全身各個組織、器官，在生命活動的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用，特別是在癌癥發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮的作用已經(jīng)得到多方面的驗證。這些特點說明外泌體作為一個天然的優(yōu)秀的腫瘤標志物潛力巨大，而對于外泌體與PCa的研究目前還處于起步階段。需要注意的是，外泌體不具有疾病特異性，也不具備器官特異性，目前外泌體作為PCa的腫瘤標志物的研究中，需要解決的問題主要有3個：①迫切需要找到一種提純、分離以及鑒定外泌體的方法，盡量提高外泌體提純精度的同時減少繁雜的步驟，從而便于外泌體研究的推廣。②外泌體的來源廣泛，在血清、全血、尿液和精液等中均可檢出，不同體液的外泌體其成分、含量均有明顯差異，對于PCa外泌體的研究，在留取檢驗標本以及留取后標本的保存等問題上目前還沒有統(tǒng)一的意見。③目前有關外泌體對PCa的預后和診斷價值的研究較少，需要更多的臨床研究加以佐證。對于外泌體在該過程中發(fā)揮作用的方式亦需要進一步探討，這同時也對目前生化技術的發(fā)展提出了挑戰(zhàn)。