張玉姣,張 晶

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院心理學院,中國河南新鄉(xiāng)453003)

心磷脂是一種線粒體特異的磷脂,其在線粒體依賴的細胞凋亡過程中起著十分關(guān)鍵的作用,并且伴隨著細胞凋亡過程的進行,心磷脂本身也發(fā)生著一些相應的變化。本文就心磷脂在細胞凋亡過程中的重要作用及其在癌癥中的研究進展予以綜述。

1 心磷脂概述

1.1 心磷脂的結(jié)構(gòu)及分布

心磷脂是線粒體特異的一類磷脂,因其首次是從心臟中被分離出來的,故名心磷脂[1]。心磷脂又稱雙磷脂酰甘油,是由兩個磷酸分子和3個甘油分子構(gòu)成骨架結(jié)構(gòu),再與4個脂肪酸分子相連接組成。因其磷酸分子在生理pH條件下會被去質(zhì)子化,所以心磷脂通常帶負電荷。心磷脂主要位于線粒體內(nèi)膜,大約占總磷脂含量的25%；而線粒體內(nèi)膜上的心磷脂大約65%分布在內(nèi)小葉,其余在外小葉。心磷脂在線粒體的外膜也有大約4%的分布,特別是靠近內(nèi)、外膜間的接觸部位。在內(nèi)外膜的接觸部位,心磷脂可以到達線粒體外膜和線粒體靠細胞質(zhì)的表面。內(nèi)外膜接觸部位的形成是因為心磷脂可以和另外一種帶負電荷的磷脂分子,即磷脂酰乙醇氨(phosphatidylethanolamine,PE),形成一種非脂雙層的六角形HII相結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)有利于內(nèi)外膜的融合[2]。

1.2 心磷脂的生物學功能

心磷脂主要分布于線粒體內(nèi)膜,是維持線粒體結(jié)構(gòu)的重要組成部分。因為心磷脂在脂雙層膜中可以產(chǎn)生負曲率彈性應力,所以其對線粒體內(nèi)膜嵴保持一定的彎曲度起著關(guān)鍵的作用[3]。此外,心磷脂可以和位于線粒體內(nèi)膜上的蛋白質(zhì)(比如細胞色素c)結(jié)合,維持線粒體內(nèi)膜的穩(wěn)定。研究者直接將心磷脂合成酶基因的干擾RNA轉(zhuǎn)入HeLa細胞,發(fā)現(xiàn)心磷脂的缺乏導致大量游離細胞色素c在膜間隙堆積,使線粒體表現(xiàn)出嵴重組的征象[4]。另有研究證實,心磷脂缺乏可以破壞ATP合成酶的低聚化組裝,這將直接影響線粒體內(nèi)膜嵴結(jié)構(gòu)的形成[5]。綜上所述,心磷脂在維持線粒體正常結(jié)構(gòu)中是必不可少的。

心磷脂也能和電子傳遞鏈中的復合體相互作用。心磷脂就像膠水,緊緊地將電子傳遞鏈中的氧化磷酸化復合體連在一起[6～7]。例如:復合體Ⅲ和復合體Ⅳ可以形成一個超級復合體,進而使質(zhì)子和電子轉(zhuǎn)運產(chǎn)生ATP。這種超級復合體的形成離不開心磷脂的存在。在酵母心磷脂合成酶基因crd1缺陷株中,人們發(fā)現(xiàn)約90%的復合體Ⅲ和復合體Ⅳ表達為獨立的同型二聚體,而在crd1野生型的細胞中則可發(fā)現(xiàn)存在二者的超級復合體[6]。以上信息說明心磷脂對電子傳遞復合體的有序組織起了關(guān)鍵的作用。

2 心磷脂在細胞凋亡過程中的重新分布

2.1 心磷脂向線粒體內(nèi)膜外小葉轉(zhuǎn)移

如上所述,正常情況下心磷脂主要位于線粒體內(nèi)膜,而且主要位于線粒體內(nèi)膜的內(nèi)小葉。但是有研究發(fā)現(xiàn),在細胞凋亡早期,心磷脂在線粒體內(nèi)膜外小葉的含量增加[8]。用凋亡刺激劑星形孢菌素(staurosporine,STS)孵育人早幼粒細胞白血病HL-60細胞1.5 h,結(jié)果顯示處理組外小葉心磷脂的含量大約是未處理細胞的3倍；用腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)處理人單核細胞白血病U937細胞1.5 h,結(jié)果同樣顯示處理組細胞外小葉心磷脂的含量大約是未處理細胞的2倍[9]。這些研究表明,在細胞凋亡早期,心磷脂在線粒體內(nèi)重新分布,即在內(nèi)膜內(nèi)、外小葉中發(fā)生了遷移。這一過程的發(fā)生先于一些凋亡標記的出現(xiàn),比如磷脂酰絲氨酸外翻、DNA降解以及膜電位的變化等,但是出現(xiàn)在活性氧自由基的釋放之后[9]。此外,因為細胞色素c可以與心磷脂在外小葉發(fā)生結(jié)合[10],所以凋亡早期心磷脂向線粒體內(nèi)膜外小葉的遷移可以促進二者的結(jié)合,并使細胞色素c產(chǎn)生過氧化物酶活性,進而促發(fā)下一步凋亡過程。

2.2 心磷脂在細胞質(zhì)膜出現(xiàn)

心磷脂是線粒體特異的磷脂,一般不存在于細胞其他質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中。許多研究表明,在細胞凋亡過程中,會在質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn)心磷脂的存在[11～12]。Sorice等[11]報道,對U937細胞進行促凋亡處理后,分別利用NAO(10-N-nonyl-acridine orange)染色和抗心磷脂抗體孵育,可在共聚焦顯微鏡下觀察到質(zhì)膜上或質(zhì)膜周圍有明顯的心磷脂出現(xiàn),且這種現(xiàn)象一般出現(xiàn)在凋亡早期。據(jù)推測,質(zhì)膜上心磷脂的出現(xiàn),可能引起機體產(chǎn)生抗心磷脂抗體,進而可能引發(fā)一些自身免疫疾病,比如獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)等[11,13]。

2.3 心磷脂的降解及再循環(huán)

心磷脂在細胞發(fā)生凋亡時,不僅會在分布上發(fā)生變化,同時也伴隨著含量的一些改變。人們在動物研究中發(fā)現(xiàn),一些與凋亡有關(guān)的病理狀態(tài),比如衰老及缺血再灌注,都伴有心磷脂含量的減少[14～15]。

Kirkland等[16]在細胞水平的研究也證實了這一點。他們對培養(yǎng)的大鼠交感神經(jīng)元細胞進行凋亡誘導,即對細胞進行不加神經(jīng)生長因子處理,在一定時間之后,發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)心磷脂含量明顯降低；有些細胞內(nèi)的心磷脂甚至完全丟失。此外,Buratta等[17]在棕櫚酸誘導的膠質(zhì)母細胞瘤GL15細胞中也發(fā)現(xiàn)了心磷脂含量的降低。在細胞凋亡時,心磷脂含量的降低可能有兩方面的原因:一是合成的減少[18]；另一種就是心磷脂的降解。

心磷脂的降解是在磷脂酶的作用下發(fā)生的,之后會產(chǎn)生溶血心磷脂(LysoCL),比如單溶血心磷脂(MLCL)、雙溶血心磷脂(DLCL)等。溶血心磷脂可能會進入心磷脂的重塑,即參與心磷脂的代謝循環(huán)[19]。這一過程需要促凋亡蛋白tBid(truncated Bid,由Bid切割而來)的參與。tBid除了可以誘導線粒體形成孔狀結(jié)構(gòu)外,還具有脂轉(zhuǎn)移活性[20],可以將線粒體上降解的心磷脂即溶血心磷脂轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,然后在?；D(zhuǎn)移酶的作用下將溶血心磷脂重新合成新的心磷脂。新合成的心磷脂一方面可能通過促凋亡蛋白Bid(BH3 interacting domain death agonist)或其他脂類轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)運回線粒體；另一方面也可能被一些脂蛋白包裝,隨后通過胞吐作用被轉(zhuǎn)運出去。這在一定程度上解釋了凋亡過程發(fā)生時心磷脂含量減少及在細胞表面發(fā)現(xiàn)心磷脂的原因。其實,凋亡刺激可以加速心磷脂的代謝循環(huán),一方面可以使心磷脂合成的前體物質(zhì)磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)累積；另一方面可以加速心磷脂的降解。據(jù)此推測,一些抗凋亡蛋白(例如Bcl-2)可能通過抑制心磷脂的降解減慢其代謝循環(huán)；一些胱天蛋白酶(caspase)激活劑可以加速心磷脂的代謝循環(huán),例如:凋亡刺激后caspase可通過切割Bid產(chǎn)生tBid,從而加速心磷脂的轉(zhuǎn)運等[19]。

綜上所述,在正常狀態(tài)下,線粒體心磷脂是相對穩(wěn)定存在的；但當細胞遇到凋亡刺激時,心磷脂會發(fā)生分布的轉(zhuǎn)移、含量的減少或者代謝再循環(huán),這表明凋亡刺激對心磷脂產(chǎn)生了重要的影響,同時也意味著心磷脂參與了凋亡過程的發(fā)生。

3 在細胞凋亡過程中與心磷脂共同發(fā)揮作用的關(guān)鍵蛋白質(zhì)

心磷脂作為一個線粒體信號平臺,可以啟發(fā)凋亡[21～22]。在細胞凋亡發(fā)生時,心磷脂作為一個信號整合體,可以對細胞色素c、caspase-8和Bid發(fā)揮重要的協(xié)調(diào)作用。

3.1 心磷脂與細胞色素c

細胞色素c可以將電子從復合體Ⅲ傳遞到復合體Ⅳ,在電子傳遞鏈的氧化磷酸化過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。在細胞收到凋亡信號時,細胞色素c從線粒體中被釋放到細胞質(zhì),并在細胞質(zhì)中有效地誘導caspase級聯(lián)反應,進而引發(fā)細胞凋亡。在正常細胞中,線粒體內(nèi)約85%的細胞色素c分布在內(nèi)膜嵴,其余細胞色素c則位于內(nèi)外膜的腔隙中。在細胞發(fā)生凋亡時,總心磷脂含量減少或心磷脂不飽和?；湹难趸瘜е履そY(jié)合細胞色素c的水平下降[18,23～24]。研究報道,使用抗氧化劑[25]或者過表達氧化還原劑[26～27]會阻礙細胞色素c從線粒體的解離；而心磷脂的氧化包含活性氧自由基的產(chǎn)生,所以該過程會促進細胞色素c的釋放。

細胞色素c若要從線粒體中釋放,首先需要與心磷脂解離。這就涉及到細胞色素c產(chǎn)生的過氧化物酶活性。研究報道,細胞色素c一旦與心磷脂結(jié)合,則會產(chǎn)生顯著的過氧化物酶活性[10]。心磷脂通過疏水作用破壞細胞色素c的三級結(jié)構(gòu),從而激活細胞色素c的過氧化物酶活性[28～29]。細胞色素c在與心磷脂結(jié)合的狀態(tài)下,采用非天然構(gòu)象,可明顯地增大血紅素縫隙區(qū),從而創(chuàng)造出一個“通道”,使過氧化氫(H2O2)易于接近血紅素的結(jié)合位點[28],這樣細胞色素c就具有了過氧化物酶活性。綜上可知,細胞色素c/心磷脂復合體就相當于心磷脂特異的過氧化物酶,在H2O2的作用下,可產(chǎn)生過氧化心磷脂。該過程依賴于可利用的H2O2含量。細胞色素c和過氧化心磷脂的親和性較低。所以,心磷脂氧化之后,可促進細胞色素c的解離。研究報道,利用放線菌素D處理小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs),可引起促凋亡蛋白Bax(Bcl-2 associated X)易位到線粒體,從而促進超氧化物的產(chǎn)生和心磷脂的氧化；但是,由魚藤酮或者琥珀酸引起的超氧化自由基的產(chǎn)生并不足以引起細胞色素c產(chǎn)生過氧化物酶活性并釋放到線粒體中[30]。這些結(jié)果表明,Bax等一些促凋亡蛋白的激活是心磷脂氧化并引起細胞色素c釋放的前提條件[31]。

另一方面,在細胞發(fā)生凋亡時細胞色素c只有釋放到細胞質(zhì)中才能發(fā)揮作用。因此,細胞色素c從心磷脂解離下來后還需要進一步的轉(zhuǎn)運才能誘導下一步的凋亡。研究認為,細胞色素c向胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運有兩種與心磷脂相關(guān)的可能途徑:第一條途徑是通過過氧化心磷脂誘導線粒體內(nèi)、外膜間的蛋白質(zhì)通道復合體(即線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔)開放[32],第二條途徑是通過心磷脂招募Bcl-2家族蛋白在線粒體外膜形成孔狀結(jié)構(gòu)[33]。相關(guān)研究在培養(yǎng)的線粒體中加入過氧化心磷脂,發(fā)現(xiàn)線粒體的膜通透性增加,同時細胞色素c釋放,而這些均可以被線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔形成抑制劑環(huán)孢菌素A或米酵菌酸所抑制,表明過氧化心磷脂是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的誘導因子[32]。Bcl-2蛋白家族是在細胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一類蛋白質(zhì),其可以在線粒體外膜上形成超分子孔道,這一過程依賴于心磷脂的存在[33]。但是也有研究表明,心磷脂與Bcl-2家族蛋白形成孔狀結(jié)構(gòu)的過程無關(guān)[34]。因此,在凋亡過程中細胞色素c的轉(zhuǎn)運機制尚需要進一步的研究。

以上信息表明凋亡過程發(fā)生時,心磷脂與細胞色素c先后經(jīng)歷了過氧化物酶形成、過氧化以及解離、釋放等過程,在這些過程中心磷脂發(fā)揮了重要的作用。

3.2 心磷脂與Bid蛋白

在正常細胞中,Bid位于細胞質(zhì)。當細胞表面的凋亡受體被活化后,活化的caspase-8切割Bid,產(chǎn)生一個15 kD的C端肽段(tBid)和一個13 kD的N端肽段,tBid肽段在其N端被豆蔻酰化修飾后,便可轉(zhuǎn)位到線粒體上,與促凋亡蛋白Bax或Bak連接,并使它們別構(gòu)激活,進而使其發(fā)生同源寡聚化,在線粒體膜上形成孔狀結(jié)構(gòu),引起細胞色素c的釋放[35～36]。免疫電鏡觀察表明,tBid首先與轉(zhuǎn)位于線粒體外膜的心磷脂結(jié)合,然后再招募線粒體蛋白質(zhì)Bax或Bak的聚集[37～39]。已有研究報道,對于心磷脂缺陷的細胞,tBid結(jié)合到線粒體上的能力顯著降低[37]。然而,對于來自巴特綜合征(Barth syndrome)患者的淋巴母細胞的線粒體,盡管其缺乏酰基轉(zhuǎn)移酶tafazzin并因此缺少成熟的心磷脂,但是卻可以成功綁定tBid[40]。有意思的是,巴特綜合征淋巴母細胞中的單溶血心磷脂水平增多,推測單溶血心磷脂可以有效誘導tBid轉(zhuǎn)位于線粒體外膜。tBid與線粒體外膜之所以能夠相互作用,一種原因可能是心磷脂的負電性與tBid的螺旋發(fā)生靜電作用,但也有可能是由于tBid直接插入脂雙層中[34,41]。需要指出的是,其他的磷脂如磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)、PG、PE,也可以與tBid結(jié)合[20]。綜上表明,在細胞發(fā)生凋亡時,包括心磷脂在內(nèi)的一些磷脂可與Bid切割之后的產(chǎn)物在線粒體外膜進行結(jié)合,這對后續(xù)招募其他促凋亡蛋白(如Bax或Bak)聚集是關(guān)鍵的過程。

3.3 心磷脂與caspase-8蛋白

細胞凋亡途徑一般認為有兩條,分別是細胞外途徑和細胞內(nèi)途徑。細胞外途徑又稱細胞表面死亡受體途徑,屬于caspase-8或caspase-10依賴的途徑。細胞內(nèi)途徑與死亡受體途徑不同,它不需要通過與死亡配體的結(jié)合,而是由線粒體引發(fā)。細胞損傷后,細胞色素c釋放至胞質(zhì)中,導致一系列細胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)被激活,形成全酶復合物,構(gòu)成凋亡小體,激活下游的caspase,引起DNA片段化而發(fā)生細胞凋亡。

Pro-caspase-8的募集與加工并形成有活性的caspase-8是死亡受體介導的細胞凋亡中的一個關(guān)鍵過程。Pro-caspase-8被證明主要定位在線粒體,在凋亡刺激下被活化[42]。一些研究表明,Fas死亡受體(Fas cell surface death receptor)的激活可誘導活化的caspase-8轉(zhuǎn)位到線粒體外膜,并且這一過程依賴于線粒體外膜成熟心磷脂的存在[40]。心磷脂在這些過程中的作用可利用取自巴特綜合征患者的淋巴母細胞進行證明。巴特綜合征常累及酰基轉(zhuǎn)移酶基因(tafazzin)的突變,tafazzin主要用于催化不飽和?；湉牧字Ｄ憠A轉(zhuǎn)移到單溶血心磷脂。Tafazzin基因的功能喪失可導致總心磷脂水平減少,包括成熟心磷脂的減少,但單溶血心磷脂增加。巴特綜合征患者的淋巴母細胞顯示其強烈抵抗死亡受體激活。然而,利用重組tBid處理從巴特綜合征患者淋巴母細胞中獲得的線粒體卻可以誘導Bak寡聚化和細胞色素c釋放[40]。所以,在巴特綜合征患者淋巴母細胞中tBid與Bax促進線粒體外膜通透化和細胞色素c的釋放可能是由于增加了大量的單溶血心磷脂。進一步的研究發(fā)現(xiàn),用Fas(一種介導細胞凋亡的細胞因子)刺激巴特綜合征患者來源的細胞,可對Bid的切割產(chǎn)生明顯的抑制作用,這表明巴特綜合征患者細胞中存在caspase-8激活的缺陷。此外,在tafazzin基因敲除的HeLa細胞的線粒體中,人們發(fā)現(xiàn)加工后的caspase-8和切割后的Bid水平顯著降低[40]。這些信息表明,成熟的心磷脂在Fas誘導的細胞凋亡中對caspase-8的激活發(fā)揮著重要的作用,提示心磷脂參與了細胞外凋亡途徑。

綜上所述,在凋亡過程發(fā)生時,心磷脂作為一個平臺,可以將細胞色素c、Bid、caspase-8等蛋白質(zhì)匯聚在一起,共同參與多個凋亡時期的過程,協(xié)調(diào)細胞程序性死亡。

4 心磷脂對細胞凋亡的作用在癌癥中的研究

關(guān)于細胞凋亡的研究,人們最希望的是能找到一種特異性誘導癌細胞凋亡的方法。心磷脂是線粒體特異的磷脂,其對線粒體誘導的凋亡起著重要作用,與此同時,心磷脂相關(guān)的癌癥方面的研究也引起越來越多的關(guān)注。例如:向?qū)m頸癌細胞中導入心磷脂合成酶基因的干擾RNA,可降低心磷脂合成,從而增加宮頸癌細胞對凋亡刺激的敏感性[4]。近年來,相關(guān)研究人工合成了一種新型芳烴-尿素脂肪酸,發(fā)現(xiàn)這種脂肪酸可以靶向乳腺癌細胞(MDA-MB-231)的線粒體,并耗盡線粒體上的心磷脂,表明這種芳烴-尿素脂肪酸可以使乳腺癌細胞的增殖能力下降,凋亡活性增強[43]。有研究將制作的細胞色素c-心磷脂(Cyt-CL)納米微球孵育處理人卵巢癌細胞株(A2780),發(fā)現(xiàn)這種納米微球可以促進卵巢癌細胞的凋亡[44]。研究報道,線粒體心磷脂中脂肪鏈的組成對前列腺癌細胞的增殖有不同的作用,與星形孢菌素STS處理過的細胞相比,棕櫚酸對前列腺癌細胞(PC-3)的增殖有促進作用,油酸對前列腺癌細胞的增殖有抑制作用[45],這說明不同脂肪酸種類的心磷脂對細胞凋亡可發(fā)揮不同的抵抗力。除此之外,研究人員在大鼠癌癥惡病質(zhì)模型中發(fā)現(xiàn),肝細胞中腫瘤壞死因子-α的高度表達,可以通過促進心磷脂的合成增加肝細胞線粒體內(nèi)心磷脂的總含量,從而使線粒體能量浪費,并影響其生理功能[46]。綜上研究,心磷脂與很多癌癥細胞的凋亡和增殖有重要的相關(guān)性,如果能找到心磷脂相關(guān)的誘導癌細胞凋亡的方法,從而開展腫瘤靶向治療,那將是一種很有前途的治療癌癥的方法。

5 結(jié)語與展望

心磷脂是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與凋亡關(guān)系密切的脂質(zhì),其與凋亡關(guān)系的研究得到高度重視。心磷脂是線粒體特異的磷脂,其分布決定了其功能的重要性。在線粒體內(nèi),心磷脂可以維持線粒體的結(jié)構(gòu),也可以與線粒體蛋白質(zhì)相互作用。心磷脂-細胞色素c復合體為細胞凋亡的起始設定了節(jié)奏,心磷脂與細胞色素c的相互作用也成為了如今細胞凋亡相關(guān)研究的新熱點。心磷脂的過氧化促進了細胞色素c的釋放,同時心磷脂自身也伴隨著含量的降低及重新分布。除此之外,心磷脂作為一個平臺,與細胞色素c、Bid、caspase-8等蛋白質(zhì)相互作用,協(xié)調(diào)細胞程序性死亡。總之,在細胞凋亡過程中,心磷脂對線粒體內(nèi)凋亡蛋白質(zhì)作用的發(fā)揮具有必不可少的作用,因此也受到越來越多癌癥研究者的關(guān)注。

另外,細胞發(fā)生凋亡時,常伴隨著形態(tài)學的改變,比如細胞皺縮。細胞皺縮是由細胞內(nèi)一些離子及水分的流失造成的,這一過程的發(fā)生離不開離子通道的開放[47]。許多研究已經(jīng)證明,一些離子通道開放劑或阻斷劑可以調(diào)控細胞凋亡過程的發(fā)生[48～49]。另外,許多膜脂具有調(diào)控離子通道的功能[50～52]。心磷脂也是一種脂類,在細胞凋亡時位置的遷移使之更有機會靠近細胞膜上的離子通道,其間會不會引起離子通道功能或開放狀態(tài)的改變將會是我們研究的一個新方向。這一領域的研究或?qū)槲覀兏钊氲亓私饧毎蛲龅臋C制開辟新視角。