修亦斌

[摘要] 目的 探討外源性肝細胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）對腹膜纖維化的影響。 方法 將HPMCs通過胰蛋白酶消化法從大網(wǎng)膜組織中分離并實施原代培養(yǎng)。后取第三代HPMCs，并在不同葡萄糖濃度（5.5、30、60 mmol/L D-葡萄糖）環(huán)境下持續(xù)培養(yǎng)48 h后對FN蛋白、TGF-β1水平進行檢測、比較，并在60 mmol/L葡萄糖溶液中加入不同濃度的rhHGF（25、50、100 ng/mL）檢測FN蛋白、TGF-β1水平，檢測方式以ELISA方式開展。 結(jié)果 （1）HPMCs在高糖環(huán)境下TGF-β1、FN蛋白水平均較N組明顯增加（P<0.05），呈現(xiàn)劑量依賴關系（P<0.05）;（2）外源性HGF可對HPMCs在TGF-β1、FN的表達產(chǎn)生抑制效果（P<0.05），呈現(xiàn)劑量依賴關系（P<0.05）。 結(jié)論 高糖環(huán)境有利于促進HPMCs的TGF-β1表達，同時促進HPMCs合成ECM;高糖誘導ECM過程可在外源性HGF影響下發(fā)生抑制，提示在腹膜纖維化過程中HGF具有抑制作用，為PD相關腹膜纖維化的預防及治療提供理論依據(jù)。

[關鍵詞] 高糖環(huán)境;人腹膜間皮細胞;肝細胞生長因子;纖維化

[中圖分類號] R587.2;R572? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）34-0018-03

Effect of hepatocyte growth factor on peritoneal fibrosis induced by high glucose

XIU Yibin

Emergency Department， Zhongshan Hospital of Xiamen University， Xiamen? ?361004， China

[Abstract] Objective To explore the effect of exogenous hepatocyte growth factor（HGF） on peritoneal fibrosis. Methods HPMCs were isolated from the greater omentum issue by tryps in digestion， and primary culture was carried out. After that， the third-generation HPMCs were and cultured continuously for 48 hours at different glucose concentrations（5.5， 30， 60 mmol/L D-glucose） and FN protein and TGF-β1 levels were detected， in the 60 mmol/L glucose environment added with rhHGF of different concentrations（25， 50， 100 ng/mL） and FN protein and TGF-β1 levels were detected and compared by ELISA. Results （1）TGF-β1 and FN protein levels of HPMCs in the high glucose environment were significantly increased compared with those in the N group（P<0.05） and a dose-effect relationship was observed（P<0.05）. （2）The expression of TGF-β1 and FN in HPMCs was inhibited by exogenous HGF （P<0.05）， and a dose-effect relationship was observed（P<0.05）. Conclusion High glucose environment promotes the expression of TGF-β1 and the synthesis of ECM in HPMCs. The process of high glucose inducing ECM can be inhibited under the influence of exogenous HGF， suggesting that HGF has an inhibitory effect in the process of peritoneal fibrosis， which provides theoretical basis for the prevention and treatment of PD related peritoneal fibrosis.

[Key words] High glucose environment; Human peritoneal mesothelial cells; Hepatocyte growth factor; Fibrosis

腹膜透析（Peritoneal dialysis，PD）為有效的終末性腎病腎臟替代治療方法，與常規(guī)血液透析治療相比，能使患者得到更高的生活質(zhì)量[1]。但在腹膜透析長期治療過程中可出現(xiàn)纖維化病變，對超濾治療產(chǎn)生負性影響，增加超濾失敗發(fā)生風險，因此發(fā)生溶質(zhì)清除障礙，為PD治療難以保持長期療效的原因之一[2]。傳統(tǒng)腹膜透析液（Peritoneal dialysis fluid，PDF）中含有葡萄糖降解產(chǎn)物（GDP）、低pH、乳酸鹽緩沖液、高糖等不相容生物成分，為腹膜損傷、腹膜纖維化的重要原因[3]。

目前在腹膜纖維化發(fā)生原因研究中，已經(jīng)明確證實PMCs的EMT為誘發(fā)腹膜纖維化關鍵過程，且由TGF-β介導EMT觸發(fā)并維持[4]。而HGF可在TGF-β1所致的纖維化作用中，具有特異性對抗作用，因此在慢性纖維化發(fā)生機制中HGF和TGF-β1之間的平衡起到?jīng)Q定性作用[5]。但目前在腹膜纖維化的HGF相關因素研究較少。本次在探討高糖環(huán)境下rhHGF對原代培養(yǎng)的HPMCs是否存在TGF-β1表達影響，以及是否可抑制HPMCs的EMT、ECM產(chǎn)生，以為防治PD相關腹膜纖維化提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 試劑? 人FN ELISA試劑盒;人TGF-β1 ELISA試劑盒;重組人HGF;即用型兔抗人波形蛋白多克隆抗體，即用型兔抗人細胞角蛋白多克隆抗體，即用型鼠抗人白細胞CD45抗體;雙抗（青霉素-鏈霉素）。

1.1.2 儀器? DU650紫外分光光度計;ELXSOO型酶標儀;UVIPRO凝膠成像系統(tǒng);Olympus1×50倒置顯微鏡;凝膠電泳儀;HERA cell CO2培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 細胞原代培養(yǎng)? 選擇期腹部手術(shù)治療患者無菌大網(wǎng)膜為細胞培養(yǎng)對象，面積約15 cm2，排除尿毒癥、惡性腫瘤患者;將網(wǎng)膜組織消化、離心、重懸細胞，并接種于培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)。之后進行HPMCs傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第二代時，以EliVision TM二步法（非生物素即用型）進行免疫組織化學染色鑒定，顯色選DAB，免疫組化染色對象為抗人波形蛋白、抗人CD45、抗第Ⅷ因子、抗人角蛋白等;持續(xù)細胞原代培養(yǎng)，至第三代后，進行試驗研究。

1.2.2 細胞分組? 不同葡萄糖濃度組：培養(yǎng)液GLU終濃度為5.5 mmol/L作為正常對照組（N組）。GLU終濃度為30 mmol/L、60 mmol/L的培養(yǎng)液為G30、G60組。

HGF干預組 G60組：選濃度為60 mmol/L的葡萄糖新鮮培養(yǎng)液作為干預對照組。分別另加入rhHGF終濃度為25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL為H25、H50、H100組，持續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集上清至冷凍管中，并放置在-80℃冰箱中保存、待檢。

1.2.3 FN和TGF-β1的蛋白質(zhì)含量測定? 收集的細胞培養(yǎng)上清液，細胞消化后計數(shù)，采用ELISA法檢測蛋白質(zhì)含量，先使用標準品建立標準曲線，經(jīng)稀釋、溫育、洗板、顯色、終止等步驟，450 nm波長依序測定各孔吸光度，根據(jù)樣品吸光度在標準曲線上得出相應濃度，用細胞數(shù)校正，計算每105個細胞分泌的蛋白量。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)計算統(tǒng)計選用SSPS17.0進行處理;計量資料（指標水平等）均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，若多組間均數(shù)比較則以單因素方差分析（one-factor ANOVA）進行;組間顯著性分析采用LSD-t法行兩兩比較;若方差不齊，以Kruskal-Wallis H檢驗多組間均數(shù)比較，方差齊性檢驗以Levene法進行;以Mann-Whitney U檢驗行組間兩兩比較;α=0.05，P<0.05提示組間比較存在統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)、鑒定

2.1.1 細胞生長情況? 原代消化下細胞初始生長形態(tài)為梭形成纖維細胞（封三圖1）;后逐漸融合為單層，倒置相差顯微鏡下呈現(xiàn)“鋪路石樣”典型細胞外觀（封三圖2）。以上細胞生長特點與文獻報道中腹膜間皮細胞特點相符合。

2.1.2 免疫組織化學染色及鑒定? 免疫組化顯示，第二代HPMCs中表達為陰性的為白細胞CD45抗原、第Ⅷ因子相關抗原，表達為陽性的為波形蛋白抗原、角蛋白。

2.2清液中FN、TGF-β1的含量

繪制標準曲線，曲線橫坐標線標注濃度（對數(shù)坐標），縱坐標為檢測出OD值，依據(jù)曲線方程計算出樣品濃度后進行統(tǒng)計分析。

2.2.1 高糖對人腹膜間皮細胞分泌FN、TGF-β1的影響? FN、TGF-β1分泌濃度在不同葡萄糖培養(yǎng)環(huán)境下存在統(tǒng)計學差異，見表1。

2.2.2 高糖環(huán)境下人腹膜間皮細胞在HGF影響下對FN、TGF-β1分泌的影響? FN、TGF-β1的分泌濃度在不同濃度rhHGF影響下存在顯著差異，呈現(xiàn)劑量依賴關系，見表2。

3討論

腹膜由具有上皮細胞特性的單層PMCs所覆蓋，PMCs對于腹膜結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定和維持具有重要作用[6]。體外培養(yǎng)中，PMCs與腹膜間皮干細胞免疫組化標記相同，因此在進行細胞活力、細胞增殖能力、細胞蛋白合成等細胞功能研究中，采用體外培養(yǎng)的PMCs可作為細胞模型實施不同因子及刺激細胞功能影響研究。本次研究細胞均為人健康大網(wǎng)膜細胞，通過胰蛋白酶消化法獲取。顯微鏡下顯示，獲取的健康大網(wǎng)膜細胞初始形態(tài)為梭形纖維樣，后逐漸生長、融合，形成單層、大小結(jié)構(gòu)相似的多邊形細胞結(jié)構(gòu)，倒置顯微鏡下，獲取試驗細胞出現(xiàn)橢圓鋪路石樣典型細胞結(jié)構(gòu)，其形態(tài)特征與相關文獻報道中腹膜間皮細胞相符[7]，并在免疫組織化學染色后證實細胞純度高。

PD已被證明是ESRD患者有效的腎替代治療方法，維持長期腹膜透析的基礎為保持腹膜功能與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[8]，而經(jīng)長期PD治療的患者極易發(fā)生纖維化，對超濾效果具有顯著負性影響，增加治療失敗發(fā)生風險，最終需退出腹膜透析治療。目前認為腹膜長期暴露于生物相容性較差的腹膜透析液中，為引發(fā)腹膜纖維化的主要原因，可因此發(fā)生血管病變、腹膜纖維化、腹膜損傷、新生血管生成等[3]。我國目前普遍選用滲透劑為葡萄糖的商用PDF治療，而目前認為高濃度葡萄糖是腹膜纖維化及增厚重要始動因子[9]。

目前腹膜纖維化發(fā)生機制仍未完全明確，但相關研究顯示，腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，PMCs的EMT起到關鍵作用[10]。成纖維細胞大量增殖代表了組織纖維化的發(fā)生，目前認為它們主要來源于經(jīng)過EMT的PMCs[11]。目前仍不清楚EMT分子機制，但有證據(jù)證實誘導EMT關鍵介質(zhì)為TGF-β1[12]。TGF-β1家族是一種多功能的細胞因子，在不同器官組織纖維化中均積極參與，同時被認為其是腹膜高糖環(huán)境下發(fā)生纖維化的關鍵誘導因子[13]。有研究[14]用TGF-β1刺激體外培養(yǎng)的HPMCs后發(fā)生EMT。本實驗結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的HPMCs在高糖的刺激下，TGF-β1、FN蛋白水平的表達量明顯增加，并且與葡萄糖的濃度呈正相關，F(xiàn)N是ECM的主要結(jié)構(gòu)成份，說明HPMCs在高糖的刺激下發(fā)生了EMT， ECM的合成能力增強，促進腹膜纖維化的發(fā)生，提示HPMCs可能在TGF-β1的誘導下發(fā)生了EMT及ECM表達增加。

隨著對腹膜纖維化分子機制認知的增加，腹膜纖維化新的預防治療策略為針對確切分子通路干預，包括阻斷TGF-β1信號傳導通路、抑制TGF-β1表達[15]、抑制阻斷及其誘導的EMT[16-17]、改進PDF的生物不相容性（以其他滲透劑替代葡萄糖）以改善PD相關腹膜纖維化。相關研究表示，抗纖維化主要內(nèi)在因子為HGF，能夠?qū)筎GF-β1導致的纖維化進程，延緩或阻止器官組織纖維化形成[18]，包括腎間質(zhì)纖維化[19]。

目前在腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展中關于HGF影響報道較少，但我們發(fā)現(xiàn)，部分腹膜透析治療患者在非生理性腹膜透析液長期暴露下仍可保持相對穩(wěn)定，說明機體自身存在能夠?qū)怪吕w維化因子刺激的保護系統(tǒng)，其中HGF為機體保護系統(tǒng)中重要組成成分。HGF由HPMCs合成，但在高糖環(huán)境下HPMCs合成能力下降，使HGF產(chǎn)物含量下降，說明機體存在抗腹膜纖維化系統(tǒng)，但受高糖環(huán)境刺激下抑制能力減弱，為腹膜纖維化主要成因之一[20]。

本次研究中，在加入不同濃度的外源性rhHGF后，在高糖環(huán)境培養(yǎng)下HPMCs的FN、TGF-β1水平均明顯抑制（P<0.05），說明外源性rhHGF能夠抑制HPMCs的EMT及ECM合成上調(diào)，從而起到抗腹膜纖維化的作用。

綜上所述，含有高葡萄糖濃度PDF可誘導HPMCs TGF-β1表達上調(diào)，使HPMCs發(fā)生EMT，進而使ECM合成能力增強，為PD發(fā)生腹膜纖維化主要機制之一。HGF為存在于體內(nèi)的抗纖維化因子，外源補充后可抑制腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展過程，達到預防、延緩腹膜纖維化形成效果。但因腹膜纖維化發(fā)生、發(fā)展過程較為復雜，存在眾多細胞因子及炎性因子相互影響、相互作用，出現(xiàn)不同信號通路間相互抑制、相互調(diào)節(jié);HGF生物學活性廣泛，可在不同類型細胞及分子機制細胞中以不同抑制機制降低纖維化發(fā)生率。但在抑制腹膜纖維化形成過程中HGF作用機制及PD動物模型及患者中腹膜纖維化影響效果仍需進一步研究。

[參考文獻]

[1] 中國腹膜透析相關感染防治專家組. 腹膜透析相關感染的防治指南[J]. 中華腎臟病雜志，2018，34（2）：139-148.

[2] 郭淑婷，唐閣，李維.腹膜透析致腹膜纖維化的發(fā)生機制及其防治的研究進展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2018，45（3）：651-653.

[3] 師紅紅，王利華. 腹膜透析相關性腹膜纖維化防治的研究進展[J]. 國際移植與血液凈化雜志，2017，15（6）：13-18.

[4] Strippoli RM-VR，Battistelli C，Cicchini C，et al. Molecular mechanisms underlying peritoneal EMT and fibrosis[J].Stem Cells Int，2016，2016：3543678.

[5] 陳建泉，張建成，陳林，等. 肝細胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β1對人心房成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2及組織抑制劑-2表達的影響[J]. 中華心律失常學雜志，2017，21（6）：489-495.

[6] 陳續(xù)紅. 腹膜透析腹膜失功能的防治[J]. 中國血液凈化，2015，14（9）：512-514.

[7] 李相友，伍軍，羅丹，等. 高糖腹膜透析液對人腹膜間皮細胞NLRP3-IL-1β的影響[J]. 北京大學學報：醫(yī)學版，2017（49）：960.

[8] 中國腹膜透析置管專家組. 中國腹膜透析置管指南[J]. 中華腎臟病雜志， 2016， 32（11）：867-871.

[9] 聶振禹，洪夢琪，包蓓艷，等.高糖腹膜透析液對HPMECs中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達的影響研究[J].浙江醫(yī)學，2017，39（8）：606-609，613.

[10] Xiang S，Li M，Xie X，et al. Rapamycin inhibits epithelial to-mesenchymal transition of peritoneal mesothelium cells through regulation of Rho GTPases[J]. Febs J，2016， 283：2309-2325.

[11] 趙俊麗，邵霞，閔丹燕，等. 姜黃素對高糖腹膜透析液作用下人腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2018，19（12）：10-14.

[12] 白壽軍，王亞琨，高聰普，等. Par6對TGF-β1誘導的腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響[J]. 中華腎臟病雜志，2016，32（8）：626-627.

[13] 劉晶，朱微，蔣春明，等. 低密度脂蛋白受體表達失調(diào)在高糖腹膜透析液誘導腹膜纖維化中的作用[J]. 中華腎臟病雜志，2018，34（6）：432-438.

[14] Wang S，DeNichilo M，Brubaker C，et al. Connective tissue growth factor in tubulointerstitial injury of diabetic nephropathy[J]. Kidney Int，2001，60：96-105.

[15] 史偉文，熊燕移，李敏芝，等.褪黑素通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路抗腹膜透析相關性腹膜纖維化[J].中國臨床研究，2017，30（5）：626-630.

[16] 李歸雁，張莉. 腹膜透析相關性腹膜纖維化的機制[J]. 現(xiàn)代醫(yī)學，2017（8）：129-134.

[17] 潘晶，章科娜，柴可夫，等.基于SIRT1/TGF-β1/Smad通路研究三七皂苷對高糖誘導的大鼠腎小管上皮細胞EMT的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學學報，2018，42（4）：259-265，282.

[18] Xu J，Yu TT，Zhang K.HGF alleviates renal interstitial fibrosis via inhibiting the TGF-beta 1/SMAD pathway[J].European Review For Medical And Pharmacological Sciences，2018，22：7621-7627.

[19] 王子杰. 腎微血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化在移植腎間質(zhì)纖維化形成中的作用及肝細胞生長因子的干預研究[D].南京醫(yī)科大學，2018.

[20] Isabelle Matte，Perrine Garde-Granger. Ascites from ovarian cancer patients stimulates MUC16 mucin expression and secretion in human peritoneal mesothelial cells through an Akt-dependent pathway[J].BMC Cancer，2019， 19（1）：406-410.

（收稿日期：2019-09-24）