易小敏　張珺　梁宇　沈群山　李海波

[摘要] 目的 研究沉默lncRNA PCA3對前列腺癌細(xì)胞的影響。 方法 選擇前列腺癌細(xì)胞LNCaP和C4-2細(xì)胞，使用siRNA干擾PCA3在細(xì)胞內(nèi)的表達，實時定量PCR法檢測干擾效果，檢測siRNA干擾PCA3后對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，Western blot法在前列腺癌C4-2細(xì)胞內(nèi)分別檢測雄激素受體及其變體7的表達情況。 結(jié)果 PCA3特異性的siRNA可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞內(nèi)PCA3 mRNA的表達，抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲潛能。沉默PCA3后的C4-2細(xì)胞內(nèi)雄激素受體及其變體7表達明顯減少。 結(jié)論 沉默lncRNA PCA3可減少前列腺癌細(xì)胞內(nèi)AR及AR-V7的表達，從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移等惡性轉(zhuǎn)變。

[關(guān)鍵詞] 長鏈非編碼RNA;PCA3;siRNA;前列腺癌;雄激素受體

[中圖分類號] R737.2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）34-0021-05

Effect of silencing lncRNA PCA3 on reduction of prostate androgen receptor expression and inhibition of prostate cancer cell proliferation and metastasis

YI Xiaomin1， 2? ?ZHANG Jun1? ?LIANG Yu1? ?SHEN Qunshan1? ?LI Haibo1

1.Department of Urology， the 901 Hospital of PLA， Hefei? ?230031， China; 2.Department of Urology， the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing? ?210029， China

[Abstract] Objective To study the effect of silencing lncRNA PCA3 on prostate cancer cells. Methods The prostate cancer cells LNCaP and C4-2 cells were selected， and siRNA was used to interfere with the expression of PCA3 in cells. The interference effect was detected by real-time quantitative PCR， and the effects of siRNA on PCA3 proliferation， migration and invasion of prostate cancer cells were detected. Western blot method was used to investigate the expression of androgen receptor and its variant 7 in prostate cancer C4-2 cells. Results The expression of PCA3 mRNA in prostate cancer cells and the proliferation， migration and invasion potential of prostate cancer cells were significantly inhibited by CA3-specific siRNA. The expression of androgen receptor and its variant 7 in C4-2 cells after silencing PCA3 was significantly reduced. Conclusion Silencing lncRNA PCA3 can reduce the expression of AR and AR-V7 in prostate cancer cells， thereby inhibiting the malignant transformation of prostate cancer cells， such as proliferation and migration.

[Key words] Long-chain non-coding RNA; PCA3; siRNA; Prostate cancer; Androgen receptor

前列腺癌在歐美國家已經(jīng)成為發(fā)病率最高的男性惡性腫瘤，嚴(yán)重危害男性健康。我國前列腺癌的發(fā)病率也在不斷攀升，患病群體也有年輕化的趨勢。早期局限性的前列腺癌可通過手術(shù)和放射治療等綜合治療達到治愈，但在發(fā)病早期多數(shù)患者并不會出現(xiàn)明顯不適。只有在腫瘤遷延進展、侵犯臨近組織甚至發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后，方有可能被患者察覺。通過手術(shù)或藥物去勢的雄激素剝奪治療是晚期前列腺癌的主要治療方法，但多數(shù)患者在經(jīng)歷大約16個月之后都將轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔–astration resistant prostate cancer，CRPC），此時繼續(xù)行雄激素剝奪的內(nèi)分泌治療不再有效[1]。

早期前列腺癌細(xì)胞依賴雄激素-雄激素受體信號軸不斷增殖是前列腺癌內(nèi)分泌治療方案的基礎(chǔ)。正常前列腺上皮細(xì)胞和前列腺癌上皮細(xì)胞在雄激素激活雄激素受體后可產(chǎn)生前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）并維持存活。前列腺癌的雄激素受體（Androgen receptor，AR）還可出現(xiàn)異常剪接，形成不同的雄激素受體變體（AR Variants，AR-V），而變體同源/異源二聚體化后能夠不依賴雄激素實現(xiàn)自激活維持增殖信號[2]。明顯升高的雄激素受體變體7（AR-V7）水平直接關(guān)系到前列腺癌的治療效果，也是前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生去勢抵抗的一個重要因素[3，4]。

非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機制中發(fā)揮重要作用，非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）是一種不能夠翻譯為蛋白的功能性RNA序列，常見的具有調(diào)控作用的非編碼RNA包括小干擾RNA、miRNA、piRNA以及長鏈非編碼RNA。PCA3（Prostate Cancer Associated 3）是一個僅在前列腺組織內(nèi)特異性表達的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），其基因座位于9號染色體q21～22。前列腺癌內(nèi)PCA3的表達水平可達到正常前列腺組織的66倍[5]。不僅如此，PCA3高表達還可增加前列腺癌細(xì)胞內(nèi)雄激素受體的表達水平[6]，通過AR信號通路增強前列腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。盡管PCA3在前列腺癌內(nèi)的特異性高表達已被熟知，對PCA3在前列腺癌中的調(diào)控機制作用尚未闡明。本研究在前列腺癌細(xì)胞LNCaP及C4-2內(nèi)調(diào)節(jié)PCA3表達，發(fā)現(xiàn)沉默PCA3可減少AR及AR-V7的形成，從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移等惡性轉(zhuǎn)變。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌細(xì)胞LNCaP購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心，前列腺癌細(xì)胞C4-2為本實驗室保存，使用RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清，于37℃含5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 瞬時轉(zhuǎn)染

siRNA由上海生工生物合成，靶向PCA3的siRNA（siPCA3）正義鏈5CUAGCACACAGCAUGAUCAUU-ACGG3，陰性對照序列Scrambled RNA（scrPCA3）正義鏈5GCACGCUCCUACGAAUGCUAGUAAA3，反義鏈均為互補。前列腺癌細(xì)胞使用siPCA3處理為siPCA3組，使用scrPCA3處理為scrPCA3組。轉(zhuǎn)染前1 d接種前列腺癌細(xì)胞至6孔板，轉(zhuǎn)染當(dāng)天查看細(xì)胞貼壁生長良好后，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書準(zhǔn)備siRNA及脂質(zhì)體的混合物，每孔加入5 μL脂質(zhì)體及50 pmol的siRNA，終體積用無血清培養(yǎng)基加至2 mL。6 h后輕輕吸去培養(yǎng)基并更換含血清新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 h后收取樣本，使用Trizol（美國Invitrogen公司）試劑盒提取總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA進行下一步實驗。

1.3 實時定量PCR

使用SYBR綠色熒光標(biāo)記的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（Takara公司）及ABIPRISM7300Real-TimePCR儀進行實時定量PCR檢測。按如下反應(yīng)體系進行配置：2×SYBR Premix Ex TaqTM Buffer 10 μL，cDNA 模板50 ng，PCR上下游引物各0.8 μL，（終濃度0.4 μmol/L）;ROX Reference Dye（50x）0.4 μL，終體積為20 μL體系。特異性引物序列如下：PCA3 基因：上游：5-AGATTTGTGTGGCTGCAGC-3，下游：5-TCCTGCCCATCCTTTAAGG -3;內(nèi)參GAPDH基因：上游：5-TGACCCCTTCATTGACCTCA-3，下游：5-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 10 s，94℃ 5 s、55℃ 20 s、72℃ 31 s（共40個循環(huán)）。

1.4 Western blot

使用RIPA裂解液提取實驗組細(xì)胞總蛋白，12000 r/min離心10 min后，將蛋白上清液轉(zhuǎn)移至新EP管，BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后煮沸5 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉TBST封閉1 h，分別加入1∶1000的兔抗人AR及AR-V7一抗（英國Abcam公司）4℃過夜，TBST洗3次，加入抗兔二抗（碧云天生物）孵育1 h，TBST洗膜3次后進行顯色發(fā)光。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖

按照前述操作步驟進行siRNA轉(zhuǎn)染操作后，消化重懸細(xì)胞，以每孔5×103的密度將細(xì)胞接種于96孔板。分別于0 h、24 h、48 h、72 h在各組選3個復(fù)孔更換新鮮培養(yǎng)基100 μL，并加入10 μL CCK-8試劑（日本同仁化學(xué)研究所），37℃孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測450 nm OD值并記錄。

1.6 細(xì)胞遷移和侵襲

前列腺癌細(xì)胞接種至Transwell小室的上層，每孔1×104個細(xì)胞，加入1% FBS培養(yǎng)基 200 μL，Transwell小室下層加入600 μL含 10% FBS 的培養(yǎng)基。在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定10 min，隨后用0.5%結(jié)晶紫染色10 min。PBS清洗后棉簽擦去上室中的細(xì)胞，隨機選取5個視野對聚碳酯膜下表面的細(xì)胞進行拍照計數(shù)，取視野細(xì)胞數(shù)量進行統(tǒng)計學(xué)分析。進行細(xì)胞侵襲實驗前在Transwell小室的上室內(nèi)加入50 μL Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司），放入37℃培養(yǎng)箱6 h，等待膠凝固后加入200 μL無血清培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)箱30 min以水化基質(zhì)膠，其余操作同遷移實驗。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

以上實驗所獲取的數(shù)據(jù)均使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間差異采用t檢驗進行比較，每次實驗至少重復(fù)3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA干擾前列腺癌細(xì)胞內(nèi)PCA3表達

為明確PCA3對前列腺癌細(xì)胞的影響，我們在前列腺癌LNCaP和C4-2 細(xì)胞系中使用siRNA干擾PCA3表達。提取總RNA后用Real-time RT-PCR法檢測各組PCA3 mRNA的表達情況驗證轉(zhuǎn)染效率，以和LNCaP空白對照組的PCA3 mRNA比值進行分析。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siPCA3 36 h后，LNCaP細(xì)胞及C4-2細(xì)胞內(nèi)PCA3 mRNA表達明顯降低（P<0.05）;轉(zhuǎn)染scrPCA3后PCA3 mRNA的表達無明顯影響，這表明siPCA3可有效干擾前列腺癌細(xì)胞內(nèi)PCA3 mRNA的表達（表1）。siPCA3對LNCaP細(xì)胞的干擾效果略高于C4-2細(xì)胞組，這可能與C4-2細(xì)胞去勢抵抗的惡性表型有關(guān)。盡管檢測結(jié)果提示C4-2細(xì)胞內(nèi)的PCA3 mRNA表達有略高于LNCaP細(xì)胞對照組PCA3 mRNA表達的趨勢，兩組間未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。siPCA3良好的干擾效果保證了后續(xù)對PCA3功能的研究。

2.2 PCA3對前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

在siPCA3及scrPCA3處理前列腺癌細(xì)胞后，我們采用MTT法檢測各組細(xì)胞在不同時間點的增殖情況（表2）。結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染scrPCA3的對照組相比，轉(zhuǎn)染siPCA3后的兩株前列腺癌細(xì)胞增殖明顯受到抑制（P<0.05），這種抑制在48 h時更為明顯，但在72 h后前列腺癌細(xì)胞恢復(fù)了大部分的增殖能力，這與siPCA3瞬時轉(zhuǎn)染的起效時間相吻合，表明siRNA的干擾效果是可逆轉(zhuǎn)的。

2.3 PCA3對前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量的影響

采用細(xì)胞遷移和侵襲實驗檢測siPCA3對前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響（表3）。結(jié)果可見siPCA3干擾后的兩株前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量均低于scrPCA3對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 PCA3對前列腺癌細(xì)胞AR-V7表達的影響

雄激素受體及其變體在前列腺癌細(xì)胞的去勢抵抗進展中發(fā)揮了重要作用。為進一步分析PCA3如何實現(xiàn)對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，本實驗用Western blot法檢測雄激素不敏感的C4-2細(xì)胞內(nèi)AR及AR-V7的表達，發(fā)現(xiàn)scrPCA3處理的C4-2細(xì)胞內(nèi)有少量AR-V7的表達。siPCA3處理組AR的表達較scrPCA3組明顯減少（P<0.05），且AR-V7的表達量也明顯降低（表4）。這表明PCA3可以通過增加前列腺癌細(xì)胞內(nèi)AR-V7的表達促進前列腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等惡性進展。

3 討論

雄激素受體是激素受體家族的一個重要成員，以配體依賴的方式作為轉(zhuǎn)錄因子與不同的DNA位點結(jié)合[7，8]。雄激素受體基因位于X染色體q12區(qū)域，由8個外顯子組成。N端結(jié)構(gòu)域（NTD）內(nèi)含有轉(zhuǎn)錄活化作用的AF1，中間的DNA結(jié)合域與糖皮質(zhì)激素受體和孕激素受體類似，具有兩個可識別并結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)，其C端含有配體結(jié)合區(qū)和AF2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域[9]。AR蛋白通過一系列的折疊加工后才能擁有配體結(jié)合的功能，配體-受體結(jié)合后的AR蛋白轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，聚集共活化子并與雄激素應(yīng)答元件結(jié)合，發(fā)揮下游基因如PSA和TMPRSS2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[10]。目前已經(jīng)在去勢抵抗性前列腺癌患者中檢測出了多種AR變體，這些變體最終形成的截短體蛋白缺失了配體結(jié)合域[11，12]。更為重要的是，這些截短體能夠在缺少雄激素配體的環(huán)境中自我激活并直接調(diào)節(jié)靶基因的表達[13]。LNCaP為激素敏感性前列腺癌細(xì)胞，其自身并無明顯的AR-V7表達[14];但異位表達的AR-V7可使LNCaP成瘤裸鼠獲得去勢抵抗性，敲除AR-V7則能減弱去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力[1，15，16]。AR-V7高表達增加了患者接受根治性前列腺切除術(shù)后生化復(fù)發(fā)的風(fēng)險。與雄激素敏感的前列腺癌患者相比，這類患者的預(yù)后更差[1，17]。

自Marion首次報道DD3（即PCA3）在前列腺癌內(nèi)特異性高表達以來，針對PCA3的研究尤其是它作為前列腺腫瘤標(biāo)記物的研究亦逐漸增加[18]。尿液PCA3檢測試劑盒已在2006年獲得CE認(rèn)證，該診斷試劑盒的靈敏度及特異度均高于PSA檢測，可用來評價患者是否需要進行前列腺穿刺活檢排除前列腺癌，也有研究者使用術(shù)前PCA3檢測結(jié)果來預(yù)測前列腺癌患者的預(yù)后[19-24]。但PCA3的功能作用仍未徹底闡明，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)PCA3在雄激素-雄激素受體信號軸中起著重要的調(diào)控作用。PCA3基因座位于9號染色體短臂21～22區(qū)，與Prune同源基因2（Prune homolog 2 gene，PRUNE2/BMCC1）的6號內(nèi)含子部分成反義互補，這一特定的結(jié)構(gòu)賦予了它可能在RNA選擇性剪接和加尾中的作用[25，26]。

有研究者認(rèn)為PCA3主要通過調(diào)節(jié)AR信號通路來促進前列腺癌細(xì)胞存活與增殖[27-29]。沉默PCA3后的前列腺癌LNCaP細(xì)胞或雄激素不敏感的前列腺癌PC3及DU145細(xì)胞后，前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例明顯增加，細(xì)胞增殖也受到明顯的抑制，深入分析雄激素受體的多個靶點基因包括PSA、AR、TMPRSS2、NDRG1、GREB1、FGF8、CDK1、CDK2和PMEPA1表達水平結(jié)果顯示，這些促進前列腺癌細(xì)胞生長增殖的基因表達明顯下調(diào)[6]。本實驗在前列腺癌LNCaP及C4-2的研究結(jié)果也證實前列腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力受到明顯抑制，同時沉默PCA3表達后AR及AR-V7的表達明顯降低，這也表明PCA3在前列腺癌內(nèi)的表達與AR變體的形成密切相關(guān)，從而促使激素依賴性前列腺癌逐漸發(fā)展成為去勢抵抗性前列腺癌?；谝陨辖Y(jié)果，我們認(rèn)為PCA3可能參與了雄激素受體靶基因的調(diào)節(jié)，對PCA3調(diào)控機制的深入研究將有可能實現(xiàn)以PCA3作為前列腺癌靶點的治療方式。

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（收稿日期：2019-08-16）